论文部分内容阅读
端粒酶是真核细胞中具有逆转录酶活性,能够合成端粒DNA的核糖核蛋白复合物,而端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT)是端粒酶的核心组分。研究表明,TERT具有基因表达调控、线粒体功能调节、胁迫应激保护等非端粒功能,但是研究主要集中于动物方面,而植物端粒酶逆转录酶是否具有非端粒功能仍不明确。因此,本文旨在研究AtTERT在拟南芥及大肠杆菌体内的非端粒功能,结果如下:构建拟南芥pCAMBIA2300-GFP-AtTERT真核表达载体,通过烟草瞬时表达及拟南芥稳定表达确定GFP-AtTERT融合蛋白主要定位于细胞核,在细胞质中也有较弱定位;对转AtTERT拟南芥进行非生物胁迫抗性分析显示,转AtTERT拟南芥较野生型及突变体拟南芥抗盐性增强,而渗透胁迫抗性无显著性变化。构建pET32a/pGEX-4T-1-AtTERT原核表达载体,遗传转化大肠杆菌,诱导表达可溶性AtTERT蛋白进行功能分析,结果显示转AtTERT大肠杆菌盐胁迫抗性、渗透胁迫抗性及过氧化氢耐受性增强,而其冷冻抗性减弱。以上结果表明,AtTERT在拟南芥及大肠杆菌非生物胁迫中发挥重要作用。基于AtTERT功能结构域预测,分别构建含有AtTERT不同功能结构域的原核表达载体pET32a-P1/2/3/4,诱导纯化蛋白后ELISA鉴定其抗原性,并探究AtTERT的保守功能结构域(P4)对大肠杆菌响应非生物胁迫的影响。Protean软件分析显示,AtTERT蛋白抗原表位最可能位于氨基酸肽链的N端及中部;ELISA鉴定显示,各融合蛋白均有反应信号,而仅含有保守功能结构域的P4蛋白抗原性最强;转P4大肠杆菌盐及渗透胁迫抗性均减弱。以上结果表明,AtTERT保持各结构域的完整性是保证其行使功能的结构基础。综上,本研究初步证明AtTERT具有非端粒功能,为继续深入研究TERT蛋白非端粒功能奠定基础。