【摘 要】
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高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]是一种重要的禾谷类经济作物,具有较强的生长力,还兼具较强的耐盐碱性、抗旱性、耐高温等抗逆特性。但是,各种不良环境因素(生物胁迫和非生物胁迫)对高粱的产量和品质造成极大影响。因此,开展高粱重要抗性基因的挖掘与研究具有重要意义。14-3-3蛋白为在真核生物中广泛存在的一类保守蛋白,其在植物抵抗各种逆境中起着重要的作用。本研究采用生物信息学方法对
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高粱[Sorghum bicolor(L.)Moench]是一种重要的禾谷类经济作物,具有较强的生长力,还兼具较强的耐盐碱性、抗旱性、耐高温等抗逆特性。但是,各种不良环境因素(生物胁迫和非生物胁迫)对高粱的产量和品质造成极大影响。因此,开展高粱重要抗性基因的挖掘与研究具有重要意义。14-3-3蛋白为在真核生物中广泛存在的一类保守蛋白,其在植物抵抗各种逆境中起着重要的作用。本研究采用生物信息学方法对高粱14-3-3基因家族进行鉴定,并对其氨基酸基本理化性质、保守结构域、motif、系统进化进行分析。随后采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)对14-3-3基因家族的组织特异性、响应非生物胁迫和生物胁迫进行表达谱分析。成功克隆了3个基因,并对其原核表达条件进行探索。最后,采用蛋白纯化系统纯化上述蛋白,并用悬滴法对其晶体生长条件进行筛选。具体研究结果如下:1)利用本地BLASTp和Hmmer的方法,在高粱中鉴定出6个14-3-3家族成员,命名为SbGF14a-SbGF14f。该家族成员的蛋白序列长度介于247-266 Aa,蛋白分子量为28 k Da左右,理论等电点为4.76~5.17,偏酸性,含有多个保守motif,与玉米亲缘关系最近。2)对高粱14-3-3基因家族的组织特异性、响应非生物胁迫(盐、干旱和植物激素)和生物胁迫(PAMPs)的表达谱进行分析,结果表明14-3-3家族基因具有组织特异性,干旱胁迫、盐胁迫、PAMPs以及植物激素可诱导其成员的表达。3)克隆了SbGF14c、SbGF14d和SbGF14f基因,成功将它们构建到原核表达载体p ET-28a上,并对表达菌株、诱导温度以及IPTG诱导浓度等蛋白表达条件进行研究,最后成功获得上述蛋白的可溶性表达最佳条件。4)采用AKTA Pure蛋白纯化系统对SbGF14c、SbGF14d和SbGF14f蛋白进行纯化,并获得较高浓度与纯度的蛋白。5)采用悬滴法对SbGF14c、SbGF14d和SbGF14f蛋白的晶体生长条件进行筛选,它们分别在Index-96,Salt Rx1-28;PEG/Ion-1,PEG/Ion-2;Index-39,Index-15条件下长出晶体。最后,通过X射线单晶衍射仪对获得的晶体进行衍射,衍射结果良好,初步判断为蛋白晶体。
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