论文部分内容阅读
红曲菌(Monascus spp.)是我国传统的药食两用微生物,主要用于红曲的生产,能够产生丰富的有益次级代谢产物。红曲在我国及东南亚地区已有上千年的应用历史,广泛用作食品着色剂、防腐剂、发酵剂和中药配伍等。同时,红曲也是我国的传统出口产品。自1995年首次发现某些红曲菌株能够分泌一种肾脏毒素——桔霉素(citrinin,CIT)以来,红曲中的CIT问题已经成为红曲产品出口及新产品开发的限制性因素,因此如何控制红曲菌中的CIT至关重要。研究表明,CIT属于聚酮化合物(polyketide,PK),由包括聚酮合成酶(polyketide synthase,PKS)等相关基因组成的基因簇控制合成。但是,由于红曲菌的分子生物学研究起步较晚,而且红曲菌基因敲除效率较低,所以目前对CIT基因簇中各基因的功能和CIT的生物合成途径与调控机理知之甚少,从而为有效控制红曲产品中的CIT增加了难度。基因敲除和基因异源表达是目前广泛用于基因功能研究的分子生物学方法。在基因敲除中,如何提高基因的敲除效率至关重要。研究表明,通过敲除非同源性末端连接(non-homologous end-joining,NHEJ)途径中的关键基因(ku70、ku80和/或ligase Ⅳ)能够显著地提高真核生物中的基因敲除效率。基因敲除能够阻断生物合成途径而使突变菌株积累目标基因的前体物,而基因异源表达则能够使转化菌株分泌目标基因的合成产物,因此通过分析基因敲除与异源表达菌株中代谢产物的变化,再结合质谱、核磁等结构鉴定手段即可研究目标基因作用的底物、产物及其基因功能,从而探索微生物次生代谢产物等的生物合成途径。本研究以红色红曲菌(Monascus ruber)M7为研究对象,首先通过敲除其中的ku70、ku80和ligase Ⅳ基因构建了红曲菌的高效基因敲除体系。在此基础上,通过对M.ruber M7 基因组的分析获得了 CIT基因簇,并运用生物信息学的方法预测了该基因簇中各基因的功能。然后以基因敲除的方法对关键基因的功能进行了研究;并结合基因异源表达技术探讨了 CIT的生物合成途径。研究成果如下:1红曲菌高效基因敲除体系的构建从M rubber M7中分别克隆并敲除了ku70、ku80和ligase Ⅳ基因,分析了各敲除菌株(MrAku70、MrAku80和MrAlig4)的菌落与显微形态、产孢能力、生长速度、色素和CIT产量以及基因敲除效率。结果表明,这3个基因的敲除均不影响红曲菌的生长、形态、分化、发育、繁殖以及分泌CIT和红曲色素的能力。但是ku70、ku80和ligase Ⅳ各基因敲除菌株中其他基因(MpigC、fmndS和triA)的敲除效率均有了明显提高,分别为野生菌株的2倍、3倍和4倍,且最高的基因敲除效率达到约85%,从而成功构建了红曲菌高效基因敲除体系,为后续的基因敲除提供了材料。2红曲菌CIT合成基因簇的分析通过对M.M7基因组序列的分析,获得了包括PKS基因(命名为pksCT)在内的44 kb的CIT生物合成基因簇。该基因簇包括16个基因,分别是pksCT基因及其上游7个基因:丝氨酸水解酶(MRL1)、加氧酶(MRL2)、转录调节因子(MRL3)、醛脱氢酶(MRL4)、醛酮变位酶(MRL5)、脱氢酶(MRL6)、氧化还原酶(MRL7),以及下游8个基因:转运蛋白(MRR1,MRR8)、组氨酸磷酸酶(MRR2)、WD蛋白(MRR4)、碳酸酐酶(MRR5)、烯酰还原酶(MRR7)以及未知蛋白(MRR3,MRR6)。对pksCT结构域的分析表明,其属于非还原型PKS,具有SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT-R的结构域。序列比对分析表明,CIT基因簇中5’端的9个基因(MRL1-MRL7,pksCT和MRR1)在产CIT的不同红曲菌株和扩展青霉(Penicillium expansum)中高度保守,其中MRL3为转录调节基因,MRR1为负责物质转运的基因,MRL5编码的蛋白过短,而pksCT、MRL1、MRL2、MRL4、MRL6和MRL7为结构基因,可能直接参与CIT的生物合成,因此在接下来的基因敲除和异源表达实验中把这6个基因作为研究对象。3 CIT生物合成关键基因敲除菌株的构建及性质分析根据同源重组原理,以已建立的红曲菌高效基因敲除菌株(MrAku80)为出发菌株,分别构建了pksCT、MRL1、MRL2、MRL4、MRL6和MRL7各基因的敲除菌株 MrAku80△pksCT、MrAku80AL1、MrAku80△L2、MrAku80△L4、MrAku80△L6和MrAku80AL7,并分析了各敲除菌株在PDB培养基中CIT及其相关产物的变化。结果表明,与出发菌株MrAku80相比,MrAku80ApksCT菌株不能分泌CIT;MrAku80△L1菌株仍然能够合成CIT,但其产量比出发菌株减少了约95%;而MRL2、MRL4、MRL6和MRL7这4个基因的敲除均阻断了 CIT的合成,而且突变菌株能够产生一种新的代谢产物2,其中MrAku80△L2菌株积累的2的量非常高,达到8.6 mg/L,而 MrAku80△L4、MrAku80△L6 和 MrAku80△L7 菌株只产生微量的 2。经结构鉴定后,产物2(2,4-二羟基-3,5-二甲基-6-(1-甲基-2-氧代丙基)苯甲醛)的分子式为(C13H16O4,结合对pksCT结构域的分析,产物2应该是CIT合成途径中的第一个中间体。4基因异源表达菌株的构建、性质分析及CIT生物合成途径的推测以克隆的pksCT、MRL1、MRL2、MRL4、MRL6和MRL7基因构建了 10种不同的米曲霉异源表达菌株(A.oryzae-pksCT、A.oryzae-pksCT-L1、A.oryzae-pksCT-L1-L2、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L4、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L6、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L4-L6、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L7、A.oryzae-pksCT-Ll-L2-L4-L7、A.oryzae-pksCT-L1-L2-L6-L7和A.oryzae-pksCT-L1-L2-L4-L6-L7),并用 HPLC-MS分析了各菌株在MPM(麦芽糖-蛋白胨培养基)培养基中代谢产物的差异,对产物1-9进行分离、纯化和结构鉴定,根据不同基因表达下合成的代谢产物在结构上的差异推测出CIT的生物合成途径以及各基因的功能,即1分子的乙酰CoA和4分子的丙二酰CoA在pksCT基因编码的PKS的催化下合成末端醛基的产物2,然后MRL2基因编码的加氧酶催化产物2的C-12位的甲基氧化为醇羟基而得到产物4,随后C-12位的醇羟基被MRL7编码的氧化还原酶继续氧化为醛基(产物14),并最终被MRL4基因编码的醛脱氢酶氧化为羧基而得到产物15,合成途径中最后一步为MRL6编码的脱氢酶催化产物15的C-3位的羰基还原为羟基并环化、脱水而生成最终的产物CIT。5 pksCT基因的前体mmRNA选择性剪接的初步探讨通过对M ruber M7pksCT基因转录的mRNA的测序分析表明,该基因转录的前体mRNA存在选择性剪接的情况,即能够转录成两种不同的mRNA,其中丰度较低的mRNA序列中仅含一个位于第640-695位碱基的56 bp的内含子,而另一种丰度较高的mRNA序列中除含此内含子外,在第6549-6610位碱基处还有另外一个62 bp的内含子,这两种mRNA翻译成的PKS的结构域分别为:SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT-R 和 SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT。通过构建去除不同内含子的pksCT基因的异源表达载体,并导入米曲霉中进行表达,结果表明,只有当PKS具有完整的SAT-KS-AT-PT-ACP-CMeT-R结构域时才能合成CIT合成途径中的中间产物2,而缺失R结构域的PKS则不能合成2,也不能合成其他代谢产物。