钠尿肽(natriuretic peptide，NP)属于神经肽家族，包括心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、脑型钠尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)和C型钠尿肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。它们起源于不同的基因，但都拥有一个结构类似的17个氨基酸的功能性内环。在中枢神经系统(central nervous system，CNS)，NP参与调控情绪变化、应激激素的释放、摄食、觉醒及自主神经的节律等。然而，NP在神经信号传递和调控等方面的作用却知之甚少。双极细胞(bipolar cell，BC)是视网膜第二级神经元，它们将从光感受器获得的信号传递至无长突细胞(amacrine cell，AC)和神经节细胞(ganglion cell，GC)。根据对光反应的不同，双极细胞可分两类：ON型和OFF型。根据突触连接的类型，双极细胞也可以分为视杆型(rod bipolar cell，RBC)和视锥型(cone bipolarcell，CBC)。哺乳动物视网膜中所有的RBC都是ON型的。在本工作中，我们的研究对象主要就是ON型RBC，简称Rod-BC，这种细胞表达γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受体的两个亚型GABAA和GABAc受体，甘氨酸(glycine)受体，以及代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor,mGluR)。 本论文应用免疫组织化学方法、全细胞膜片钳记录、钙成像技术，首次系统报道了NP对Rod-BC中主要的抑制性递质GABA受体的调制作用。 首先，应用免疫组织化学技术和共聚焦显微镜技术，我们细致研究了NP及其受体NPR在大鼠视网膜中的表达情况。结果显示，很多细胞均表达NP，如内核层的细胞或部分神经节细胞，此外，在Mttller细胞和两个网状层也显示很强的NP免疫阳性。同时，NPR的表达也相当广泛，值得注意的是，在PKC标记的Rod-BC上，NPR显著地表达于其树突、胞体、轴突、轴突终末等部位。有大量的工作显示，NP在细胞中主要通过激活颗粒型鸟苷酸环化酶(particleguanylyl cyclase，pGC)活性从而增加胞内3,5’-环鸟苷酸(guanosine．3,5’-cyclicmonophosphate，cGMP)浓度实现进一步的胞内调控。电生理结果显示，在Rod-BC中可以诱导出cGMP门控通道(cGMP-gated nonselected cation channel，CGC)介导的电流，这些电流的性质与cGMP和磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)诱导电流相似。 NPR在Rod-BC上大量的功能性分布，意味着其在Rod-BC信号通路中有可能起着重要的调制作用。在研究调制作用之前，我们先用膜片钳技术分析了Rod-BC上GABA受体介导电流(尼ABA)的特性。50μM的GABA<,A>受体激动剂muscimol诱导一个瞬间失敏的内向电流IGABA(A)，其失敏的时间常数(百)为1.24 s。200μM GABAc受体激动剂cis-4-aminocrotonic acid(CACA)诱导一个持续的几乎无失敏的内向电流尼I<,GABA(C)。>GABA<,B>受体激动剂baclofen诱导不出任何可见电流。I<,GABA(A)>和I<,GABA(C)>的翻转电位分别为1.24±2.4 mV和-1.44±3.2mV。分析I<,GABA(A)>和I<,GABA(C)>对GABA的量效关系，其半反应浓度(concentrationof half-maximal response，EC<,50>)分别为51.3±6.2 μM和6.0 ±0.6μM。上述结果显示，Rod-BC上，具有GABA<,A>和GABAc受体，而没有GABAB受体。进一步的电生理实验结果显示，BNP只压抑I<,GABA(A)>，并不压抑I<,GABA(C)。>BNP对I<,GABA(A)>的压抑作用可被anantin阻断，胞外给予pGC的特异性抑制剂HS-142-1可以显著地压抑BNP的作用，此外，NPR-C受体特异性激动剂cANF<,4-23>不能模拟BNP的作用。这些结果表明，BNP的抑制作用是通过NPR-A起作用的，而NPR-C不参与此作用。应用局部加药的方式分别在Rod-BC的树突/胞体和轴突终末部位诱导I<,GABA>，而轴突终末的I<,GABA>较大(214.34±20.5 VS 108.9 ±25.5)，且BNP只对轴突终末的尼ABA有压抑作用。 我们进一步研究了BNP对轴突终末部位I<,GABA(A)>的压抑作用的胞内机制。胞外给予8Br-cGMP，可以模拟BNP的作用，即压抑I<,GABA(A)>而对I<,GABA(c)>没有作用。电极内液中给予cGMP依赖蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase G，PKG)的特异性拮抗剂KT5823，显著地削弱BNP压抑I<,GABA>的作用。这表明，cGMP/PKG通路参与BNP对I<,GABA>的压抑。钙成像实验进一步表明，BNP显著地增加Rod-BC轴突终末部位的胞内钙浓度(intracellular calcium concentration，[ca<,2+>]i)，而对树突/胞体部位的[ca<2+>]i没有影响，距离轴突终末越远，BNP可诱导的[Ca<2+>]i变化越小。此外，胞外无钙液(Ca<,2+>-free，含10 mM EGTA)灌流并不影响BNP对I<,GABA>的压抑作用；反之，在胞内无钙液(Ca<,2+>-free，含10 mMBAPTA)的条件下，BNP压抑I<,GABA>的作用几乎消失。这些结果表明，在我们的实验条件下BNP抑制I<,GABA>的作用与胞外来源的钙离子无关，而很可能是通过胞内钙库的钙释放至胞浆所致。因此，我们分别研究了下列两种胞内钙库在此过程中的作用：三磷酸肌醇(inositol 1,4，5-trisphosphate，IP<,3>)受体(IP<,3>R)介导的钙库和ryanodine受体(RyaR)介导的钙库。在IP<,3>受体的拮抗剂肝素(heparin)和xestospongins-C(Xe-C)阻断胞内IP<,3>受体介导的钙库释放的条件下，BNP仍可以显著地抑制I<,GABA>。然而，应用RyaR的调制剂咖啡因(caffein)、ryanodine(Rya)、钌红(ruthenium red)来阻断RyaR介导的钙库释放途径，可以明显地抑制BNP对I<,GABA>的作用。这说明，BNP对I<,GABA>的作用是由RyaR介导的。实际上，用钙成像的方法显示，咖啡因的确可在Rod-BC的轴突终末观察到胞内钙的升高，这说明Rod．BC的轴突终末部位很有可能存在RyaR。进一步研究表明，BNP压抑I<,GABA>的作用可以显著地被钙调蛋白(calmodulin，CaM)抑制剂W-7和calmidazolium(CMZ)所阻断。以上的结果可以总结为：BNP与NPR-A相结合，通过激活NPR-A的GC活性部位使胞内cGMP浓度增加，继而通过cGMP/PKG通路调动RyaR介导的胞内钙库，释放的钙离子与CaM相结合形成Ca<2+>-CaM复合物，从而发挥BNP对GABA受体的调制作用。 此外，还研究了BNP对另一种抑制性递质受体——甘氨酸受体的作用。在：Rod-BC上可以鉴定士的宁(strychnine)敏感的I<,Glv>，该电流的EC<,50>为40.5±5.2μM。甘氨酸受体在Rod．BC中的分布是不均衡的，I<,Glv>仅在树突/轴突上才能被诱导，而轴突上则阙如。BNP对I<,Glv>没有作用，虽然I<,Glv>可被胞内钙调制。BNP对I<,Glv>没有作用的原因很可能是BNP只能导致轴突部位的钙升高，而对树突/胞体部位没有影响。