论文部分内容阅读
纤维素是自然界中最丰富的碳水化合物,可被纤维素酶水解成可发酵的糖,是理想的化石燃料的可持续的替代能源。纤维素酶在木质纤维素材料降解中起着关键作用,目前已经有很多的纤维素酶被开发利用,但工业应用需要酶具有一些独特的性质,如耐高温、耐酸碱等。这就需要我们一方面不断开发新酶源,另一方面加深对酶催化过程的了解,不断改造出具有新功能的酶。随着分子生物学和结构生物等学科的不断进步,对纤维素酶的催化机理的研究和新酶源的开发逐步发展为两个重要的研究前沿方向。本论文从以上两个方面入手分别进行纤维素酶系PT-box Linker的功能研究和新型糖苷酶的性质研究。论文第一部分选取来源于嗜热细菌Acidothermus cellulolyticus 11B的内切纤维素酶AcCel12B为研究对象,利用分子生物学手段对其linker进行改造。AcCel12B由一个催化结构域（CD）和一个纤维素结合结构域（CBM）组成,通过48个氨基酸长的linker区域将其连接。AcCel12B的linker区域包含一段PT-box,PT-box通过两个不保守区域分别连接CD和CBM。AcCel12B的PT-box显著的特点是被甘氨酸分成两部分,两部分的氨基酸序列以甘氨酸为轴呈现对称排列。为了研究PT-box在纤维素水解中的功能,我们将PT-box的每个部分定义为一个PT-box结构单元,然后重新设计PT-box结构单元的数目来研究PT-box结构对酶功能的影响。论文通过分子生物学的方法,成功构建了纤维素酶AcCel12B和三个含有不同数目PT-box的AcCel12B的突变体（没有或1-3个PT-box）,并成功的用工程菌进行了的表达并完成了纯化。通过对纤维素酶AcCel12B和三个突变体性质研究,发现纤维素酶对Avicel和RAC的活性随着PT-box数目的增加而增加。AcCel12B和所有突变体对可溶性纤维素（CMC）的活性没有显着差异。通过研究酶对RAC水解的时间进程,发现相同的现象,纤维素酶对固体RAC的活性随着PT-box数目的增加而增加,而对水解产生的可溶性纤维素的活性没有显着差异。为了探究不同PT-box数目的纤维素酶对固体纤维素水解存在差异的原因,我们研究了纤维素酶AcCel12B和三个突变体对固体纤维素的吸附和解吸附情况,结果发现AcCel12B及其突变体从RAC和Avicel的解吸附有着显著的不同。野生型和突变体AcCel12B从纤维素中解吸的能量随着PT-box结构单位的数量而降低,而AcCel12B和突变体对RAC和Avicel的吸附情况没有明显的差异。这种规律符合其对RAC和Avicel的水解规律。根据以上研究,我们得出结论,含有更多PT-box的AcCel12B更容易从底物上解吸附,从而有更多的机会去建立新的催化水解位点,从表观上显示出更高的催化水解活力。所以纤维素酶中PT-box的数量影响酶的解吸附过程,这也是AcCel12B和其突变体对Avicel和RAC水解活力存在差异的原因。论文第二部分是从Acidothermus cellulolyticus 11B ATCC 43068中成功克隆出有一个新的β-糖苷水解酶基因。成功构建了重组工程菌的表达系统,获得了高纯度的重组β-糖苷水解酶（AcBg）。β-糖苷水解酶是纤维素降解过程中重要的酶,到目前为止,已发现的β-糖苷水解酶有很多,但有着高浓度盐耐受的酶很少,还能被多种单糖增强的酶更为稀少,然而降解纤维素工业有些需要在高浓度盐和糖的条件下进行,这要求酶有很高的盐和糖耐受性。本文发现的β-糖苷水解酶有着高浓度盐耐受,能被多种单糖增强,这种酶在已发现各种β-糖苷水解酶中并不多见。通过序列比对我们发现,该酶属于糖苷水解酶第一家族,最适pH和温度分别为7.0和70℃。在最佳条件下,AcBg对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）和纤维二糖的活力分别为290 U/mg和33 U/mg。根据HPLC分析,AcBg是从底物的非还原端顺序水解寡糖以产生葡萄糖单元。并且发现该酶能被一价阳离子增强酶活力,在5M NaCl或KCl条件下,酶活力增大约2.6倍和2.2倍,在接近饱和盐浓度条件下,酶的活力仍然是未加盐的2倍以上。二价金属离子(如Ni2+,Zn2+,Fe2+,Mn2+等)不同程度地抑制了酶的活性,其他二价金属离子对酶活性没有明显影响。AcBg还显示出单糖激活的性质。0.1M的α-甲基-D-葡萄糖能增强酶活力约1.4倍,0.2 M的D-葡萄糖增强β-葡萄糖苷酶的活性约1.9倍,1.0 M的木糖增强酶活力约1.9倍。我们测定不同葡萄糖浓度下的催化动力学和结构变化,结果表明葡萄糖能降低了酶的底物亲和力,并引起酶的构象变化。综上所述,本文发现的β-糖苷水解酶AcBg在工业应用方面和催化机理方面都有很强的研究价值。