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目的:
观察β-连环蛋白(β-catenin,β-cat)在博莱霉素(bleomycin,BLM)致小鼠肺纤维化模型中各期的表达和可溶性Frizzled相关蛋白(SFRP4)干预后其表达的变化,进一步探讨其在肺纤维化上皮-间充质转化(epitelial-mesenchymaltransition,EMT)中的作用,从而更深入地了解肺纤维化的发病机制。
方法:
将60只小鼠按随机数字表法分为3组:对照组(Cont组)、实验组(BLM组)和可溶性Frizzled相关蛋白干预组(SFRP4组),每组20只。其中BLM组和SFRP4组为博来霉素诱导的肺纤维化模型组(气管内注射BLM5mg·kg-1,0.04ml),每组20只;Cont组为正常对照组(Cont组,20只),同时间按同样方法气管内注入等体积(0.04ml)生理盐水。造模后于第2、4、6、8、10天,SFRP4组小鼠分别腹腔注射PBS稀释的SFRP4(10μg/ml)约0.2ml。Cont组及BLM组腹腔注射等体积生理盐水,每天1次。各组分别于第3、7、14和28天各处死5只小鼠,取肺组织做病理切片,用苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠肺泡炎症和肺纤维化的程度,以样本碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸(HYP)含量;免疫组化检测不同组β-cat、间充质细胞标记物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及上皮细胞标记物上皮钙黏素(E-cadherin,E-cad)的表达,并应用WesternBlot法测定β-cat、α-SMA及E-cad的表达。
结果:
(1)Cont组的小鼠肺组织病理学检查无明显改变,仅炎性细胞少量浸润,无肺泡炎性渗出,肺泡间隔无增厚,没有成纤维细胞的增殖,无明显的肺纤维化样的改变。BLM组肺组织病理切片随时间顺序呈现由肺泡炎至纤维化的动态改变,早期帅泡炎性渗出较重,肺泡间隔中有大量的炎性细胞浸润,肺泡结构变形。中晚期炎性渗出逐渐减轻,肺泡萎陷、消失,大小不等,但肺泡间隔逐渐增厚,可见成纤维细胞的大量增殖,大量宽带状及片状胶原纤维沉积,出现弥漫性纤维化病变;BLM组的肿泡炎和肺纤维化评分均高于对照组和治疗组,有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01);SFRP4组病理学检查也按时间顺序呈现由肺泡炎到肺纤维化的动念改变,但肺泡炎和肺纤维化的程度办较BLM组为轻(P＜0.05或P＜0.01)。
(2)BLM组与Cont组相比,肺组织中羟基脯氨酸含量第7天开始上升,第28天达到峰值;与BLM组对照,在第7、14、28天时,SFRP4组与其有显著差异(P＜0.01)。
(3)免疫组化示:E-Cad及α-SMA的表达主要在细胞膜上,与Cont组相比,各时间点BLM组及SFRP4组的E-Cad蛋白表达减少,并呈逐渐减少的趋势,而α-SMA蛋白表达则增多,并随着时问的推移其表达逐渐增多。Β-cat其大部分位于细胞膜上,而很少一部分位于细胞质和细胞核中。与Cont组相比,BLM组及SFRP4组各时间点β-cat蛋白在细胞质及细胞核内的表达逐渐增加,BLM组较SFRP4组较为显著。
(4)Westernblot示:Cont组小鼠各时间点α-SMA及E-cad蛋白表达差异均无显著性意义。BLM组α-SMA从3天起其表达逐渐增加,与Cont组相比,P＜0.01,而E-cad蛋白表达随时间增加而逐渐减少,与Cont组相比,P＜0.01;SFRP4组α-SMA的表达亦呈逐渐增加趋势,但较BLM组为轻,与BLM组相比,第14、28天P＜0.05,E-cad蛋白表达随时间增加亦逐渐减少,但同时间点表达较BLM组表达为多,与BLM组相比,第7、14、28天P＜0.05。
(5)Westernblot示:Cont组小鼠各时间点β-cat蛋白表达差异亦均无显著性意义。与Cont组相比较,BLM组β-cat的表达从第3天开始增高(P＜0.05),第14天达到高峰,第28天降低:SFRP4组β-cat的表达先增高后下降,但各时间点均高于Cont组(P＜0.01)。与BLM组相比较,SFRP4组,β-cat的表达均下降,其差异在第7、14、28天有统计学意义(P＜0.05)。
(6)β-cat蛋白、α-SMA及E-cad蛋白的表达与肺纤维化上皮-间充质转化可能有一定联系,其中β-cat及α-SMA蛋白的表达与其呈正相关,E-cad蛋白的表达与其呈负相关。
结论:
β-catenin在肺纤维化形成过程中存在高表达。同时在肺纤维化进程中肺泡上皮细胞进行性减少,间质细胞逐渐增加,反映在作为上皮细胞标记物上皮钙黏素(E-cadherin,E-cad)的表达逐渐减少,作为间充质细胞标记物a-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达却逐渐增加。可溶性Frizzled相关蛋白(SFRP4)对肺纤维化的早期具有一定的干预作用,推测β-cat可能参与了肺纤维化的形成,在上皮-间充质转化过程中起着促进作用。样本碱水解法