化疗是肿瘤治疗的主要手段,但免疫抑制性微环境是化疗失败的主要原因之一。肿瘤微环境中存在众多抑制性免疫细胞,其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）占比较多,而成为近期免疫治疗的新靶点。在肿瘤进展中,巨噬细胞主要有两种表型:促炎（M1）表型和抗炎（M2）表型,且TAMs多以M2表型存在,参与肿瘤的侵袭和免疫抑制,促进肿瘤生长和转移。由于其高可塑性,M2-TAMs表型逆转为M1-TAMs在调节肿瘤免疫微环境和癌症治疗方面具有重要意义。因此,本文构建一种差异化递送的纳米系统,将化疗药物和促转型药物分别递送至肿瘤细胞和TAMs,下调肿瘤微环境中抑制性免疫细胞数量,缓解免疫抑制,效应T细胞活性升高,从而增强免疫反应,提高化学治疗效果。主要研究内容如下:1、纳米系统的制备与表征首先,将阿霉素（DOX）负载于重链铁蛋白笼内（DOX@HFn）;其次,将谷氨酰胺合成酶抑制剂-蛋氨酸磺酸盐（MSO）负载于半乳糖修饰的两性离子脂质体内（MSO@GZL）;最后,通过基质金属蛋白酶敏感的底物肽连接得到DOX@HFn-MSO@PGZL纳米系统。通过核磁共振仪和傅里叶红外光谱仪对半乳糖修饰的两性离子脂质体进行结构确认,紫外可见光谱和凝胶电泳结果表明DOX@HFn-MSO@PGZL纳米系统成功制备,激光粒度分析仪测定DOX@HFnMSO@PGZL纳米系统的粒径为168.0±3.0 nm,电位为-43.5±0.9 m V。透射电镜结果显示纳米系统呈球形,分散性良好。体外释放实验揭示了DOX和MSO的释药规律,结果表明:72 h时,DOX和MSO的累积释药率分别为78.2±2.4%和80.4±2.7%。2、纳米系统体外免疫激活研究和抗肿瘤活性评价以4T1小鼠乳腺癌细胞为模型,通过激光共聚焦显微镜观察肿瘤细胞和TAMs共培养时药物的分布情况,结果显示:DOX和MSO分别通过肿瘤细胞表面转铁蛋白受体和TAMs表面半乳糖受体介导途径,被差异化精准递送至肿瘤细胞和TAMs。流式细胞术和酶联免疫试剂盒检测肿瘤细胞免疫原性死亡后,钙网蛋白和高迁移率蛋白B1的表达情况,树突状细胞（DCs）成熟标志物CD80、CD86的表达水平。结果表明:纳米系统能有效诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡,刺激树突状细胞的成熟。此外,流式细胞术和酶联免疫试剂盒检测M0型和M2型TAMs分别与纳米系统共孵育后,M1-TAMs表面标志物（CD86、白介素12）和M2-TAMs表面标志物（CD206、白介素10）的表达情况,并检测抗原呈递标志物组织相容性复合体II（MHC II）的表达水平;LC/MS法检测TAMs内谷氨酰胺和谷氨酸的含量。结果表明:纳米系统可降低细胞内谷氨酰胺含量,干扰谷氨酰胺代谢途径,促使M1-TAMs比例增加,并提高TAMs表面抗原呈递标志物MHC II表达量。3、纳米系统体内靶向性和抗肿瘤活性研究建立BABL/c荷瘤小鼠乳腺癌模型,考察纳米系统的体内靶向和抗肿瘤效果。通过小动物活体成像仪观察纳米系统的分布情况,荧光成像结果证明纳米系统可在肿瘤部位聚集,静脉注射8 h后肿瘤蓄积量达到最高,并延长了药物滞留时间。相对肿瘤体积、抑瘤率、H＆E染色切片等结果表明纳米系统能有效抑制肿瘤生长。通过检测小鼠体内谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶和尿素氮等血生化指标,评价治疗过程中肝脏和肾脏功能;检测白细胞、红细胞、血红蛋白和血小板等血液学指标,评价骨髓造血功能,初步考察纳米系统的安全性。结果显示小鼠血生化和血液学指标均处于正常范围内,纳米系统具有良好的安全性。4、纳米系统体内免疫抑制改善和免疫激活研究流式细胞术和免疫荧光法对肿瘤组织进行免疫分析,结果表明纳米系统可增加树突状细胞的成熟率和M1-TAMs的数量,下调M2-TAMs、调节性T细胞和骨髓源性抑制细胞等抑制性免疫细胞的比例,改善肿瘤免疫微环境,提高抗原呈递的效率,有效激活免疫反应。ELISA试剂盒检测肿瘤组织中免疫因子的含量,纳米系统可降低免疫抑制性因子（白介素10和生长转化因子β）分泌水平,增加免疫刺激性细胞因子（白介素12和干扰素γ）分泌水平。综上所述,本文构建的纳米递送系统可诱导肿瘤细胞发生免疫原性死亡,释放特异性抗原,促进DCs成熟。此外,通过干扰TAMs的谷氨酰胺代谢使M2型TAMs和M0型TAMs向M1表型转化,从而降低抑制性免疫细胞数量,缓解DCs功能抑制;激活自身抗原呈递能力,提高抗原呈递效率,实现肿瘤免疫化疗的高效减毒。