【摘 要】
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背景和目的原肌球蛋白受体激酶（TRK）家族包括TRKA、TRKB和TRKC蛋白并分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码,在神经系统发育中发挥重要作用。NTRK1基因融合作为TRK信号异常表达事件会导致TRKA激酶的激活,促进细胞恶性增殖,从而驱动了肿瘤进展。本实验旨在探讨NTRK1融合基因在食管鳞癌中的功能及分子机制,为含有NTRK1融合基因的食管鳞癌诊断和治疗提供参考。方法1.稳定表达
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背景和目的原肌球蛋白受体激酶（TRK）家族包括TRKA、TRKB和TRKC蛋白并分别由NTRK1、NTRK2和NTRK3基因编码,在神经系统发育中发挥重要作用。NTRK1基因融合作为TRK信号异常表达事件会导致TRKA激酶的激活,促进细胞恶性增殖,从而驱动了肿瘤进展。本实验旨在探讨NTRK1融合基因在食管鳞癌中的功能及分子机制,为含有NTRK1融合基因的食管鳞癌诊断和治疗提供参考。方法1.稳定表达NTRK1融合基因细胞的筛选和鉴定。对NTRK1融合基因慢病毒载体进行包装并感染KYSE150和ECa109细胞,用嘌呤霉素筛选稳定表达株并用Western blot实验进行鉴定。2.NTRK1融合基因功能鉴定。采用细胞计数法、克隆形成、伤口愈合、Transwell等实验探讨NTRK1融合基因对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响,并用Western blot、免疫荧光实验检测NTRK1融合基因对食管鳞癌细胞EMT过程相关蛋白的表达。3.NTRK1融合基因促癌机制探讨。首先用Western blot实验检测含有NTRK1融合基因的细胞中Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路相关蛋白表达,然后用β-catenin si RNA下调细胞中β-catenin表达,通过Transwell和Western blot实验探讨下调后NTRK1融合基因对食管鳞癌细胞迁移、侵袭及EMT过程相关蛋白表达影响的变化。4.NTRK1融合基因体内致癌能力探讨。分别用未转染和筛选的稳定表达NTRK1融合基因的细胞建立裸鼠移植瘤模型,观察并比较细胞在体内的致瘤能力,并利用Western blot实验检测EMT和Akt/GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白的表达。结果1.成功筛选出含有NTRK1融合基因的食管鳞癌细胞株。与未转染细胞相比,Flag标签及TRKA在筛选出的KYSE150和ECa109细胞中具有明显表达,提示NTRK1融合基因成功转入细胞并使TRK蛋白激活。2.NTRK1融合基因促进食管鳞癌发生发展。与未转染细胞相比,含有NTRK1融合基因的细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力明显增强,且细胞中NTRK1融合基因对食管鳞癌发生发展具有促进作用。3.NTRK1融合基因通过激活Akt/GSK-3β/β-catenin通路促进食管鳞癌发生发展。与未转染细胞相比,含有NTRK1融合基因的细胞中p-Akt（Ser473）、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin及c-Myc蛋白表达上调,且β-catenin在细胞核水平升高,提示NTRK1融合基因激活Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路。用β-catenin si RNA下调含有NTRK1融合基因的细胞中β-catenin表达后,与未下调的细胞相比,细胞迁移、侵袭能力明显减弱,且E-cadherin表达升高,而N-cadherin、Vimentin、Slug表达降低,说明下调β-catenin表达后NTRK1融合基因的促癌作用减弱,进一步证实NTRK1融合基因通过激活Akt/GSK-3β/β-catenin通路发挥促食管鳞癌作用。4.NTRK1融合基因体内促进食管鳞癌形成。与未转染细胞相比,含NTRK1融合基因形成的肿瘤生长速度更快,提示NTRK1融合基因能够促进肿瘤生长;NTRK1融合基因对食管鳞癌裸鼠移植瘤组织的EMT和Akt/GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白表达与体外结果一致。结论NTRK1融合基因能促进食管鳞癌发生发展,其机制与激活Akt/GSK-3β/β-catenin信号通路有关。
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