研究背景围产期多种因素可导致胎儿或新生儿不同程度的缺氧性脑损伤,多见于围产期窒息。脑部受到缺氧损伤可能会导致终生的智力障碍和行为能力丧失,如自闭症谱系障碍、脑性瘫痪、抑郁、癫痫和智力缺陷等。缺氧引起的脑损伤机制一直未能充分阐明,且目前尚无有效的药物及治疗方法改善围产期缺氧所致的脑损伤。随着医学的发展,虽然对于新生儿缺氧性脑损伤的研究已有一定的进展,但要达到完全阐明发病机制并最终有效治疗的目的,仍需要长期进行大量的研究工作。深入研究新生儿缺氧缺血性脑损伤发病机制、寻找有效的防治方法是国内外儿科领域的重要课题。大多数疾病的深入研究往往得益于动物疾病模型的有效建立,缺氧性脑损伤也是如此。近年来,新兴的模式生物——斑马鱼迅速成为科研者所青睐的模式生物,其在研究神经系统发育及相关疾病发生发展过程中的作用是其他模式生物难以取代的：与线虫、果蝇等经典模式生物相比,斑马鱼作为一种脊椎动物,在基因组、蛋白质组、胚胎发育以及疾病发病机制等方面均表现出与人类相似性高的特点；与小鼠相比,斑马鱼具有体积小、繁殖能力强、繁殖周期短、生长迅速、体外受精、胚胎透明等优点,因此可在体直观观察各器官系统发育过程,有利于神经系统疾病发病机制的研究及神经营养药物的高通量筛选。利用斑马鱼这一模式生物研究神经系统发育并建立缺氧性脑损伤模型,为今后缺氧性脑损伤发生机制的深入探索、新通路的发现及新药物的高通量筛选提供新的理论依据。研究目的1.模拟缺氧窒息环境,建立斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤模型,为新生儿缺氧性脑损伤提供经济、高效、便捷的实验动物模型；2.比较急、慢性缺氧时斑马鱼幼鱼脑组织氧化应激指标以及HIF-1α、EPO、p53表达的变化,分析斑马鱼幼鱼在急、慢性缺氧环境中脑组织的损伤机制,为进一步从基因水平探讨斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤发生机制提供新的思路；3.比较缺氧前、后斑马鱼幼鱼脑组织神经系统相关基因nestin、mbp、syn2a的表达差异,初步探讨差异表达的基因在缺氧后自身修复过程中的调控机制,为新生儿缺氧缺血性脑病的治疗提供新的靶点。研究方法同一批次斑马鱼产下的6dpf幼鱼随机分为正常对照组、慢性缺氧组和急性缺氧组。首先将慢性缺氧组预先放入缺氧装置,再向水中充入高纯氮气进行缺氧,到达实验终止时间点,将所有缺氧后的幼鱼捞出,即慢性缺氧组；当水中溶氧量小于0.5mg/L时,将急性缺氧组放入缺氧装置中,建立斑马鱼幼鱼急性缺氧性脑损伤模型。采用神经行为学观察、HE染色观察脑组织病理变化等方法,对斑马鱼幼鱼缺氧模型进行评价；通过活体成像技术观测各组幼鱼的存活状况、形态、心率(heart rate, HR)和运动能力等指标；HE及甲苯胺蓝神经染色后,观察受损脑组织病理形态的改变；各氧化应激指标检测试剂盒测定各组斑马鱼幼鱼脑组织一氧化氮(NO)浓度、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性等氧化应激指标,探索缺氧对斑马鱼幼鱼脑组织损伤的氧化应激机制；采用吖啶橙染色观察各实验组斑马鱼幼鱼脑部细胞的凋亡情况,用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法,对不同缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织HIF-1α、EPO、p53基因表达以及缺氧前后nestin、mbp、syn2a基因表达变化进行差异性分析。结果1.斑马鱼幼鱼缺氧性脑损伤模型和脑组织损伤评估：斑马鱼幼鱼缺氧后心率较正常组有明显差异(p<0.05),出现活力下降、游程缩短、静止不动等神经行为改变；正常对照组幼鱼脑组织结构形态无异常改变,缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织细胞出现凋亡小体,HE染色可见缺氧组幼鱼脑室萎缩,部分神经元肿胀,细胞收缩变圆,胞浆浓缩等病理变化。2.急性缺氧组和慢性缺氧组缺氧损伤程度对比a)正常对照组、慢性缺氧组、急性缺氧组心率总体均值存在差异(p<0.05),差异具有统计学意义。急性缺氧组心率较正常对照组偏快,而慢性缺氧组则较正常对照组慢；b)慢性缺氧组与急性缺氧组缺氧后复苏时间存在差异(p<0.05),急性缺氧组幼鱼缺氧后复苏时间较慢性缺氧组短,差异具有统计学意义。c)缺氧后14天内,正常对照组、慢性缺氧组、急性缺氧组的中位生存时间(天)分别为13.00、1.00、7.00,生存曲线整体Log-Rank检验分析各组生存曲线水平间的总体生存率存在差异(p<0.05),差异具有统计学意义。3.斑马鱼幼鱼各组脑组织氧化应激指标检测a)慢性缺氧组和急性缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织NO浓度较正常对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。慢性缺氧组幼鱼脑组织NO浓度较急性缺氧组高,差异具有统计学意义。b)慢性缺氧组和急性缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织MDA含量较正常对照组明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。慢性缺氧组幼鱼脑组织MDA含量较急性缺氧组高,差异有统计学意义。c)慢性缺氧组和急性缺氧组斑马鱼幼鱼脑组织SOD活性较正常对照组均明显下降,差异具有统计学意义(p<0.05)。各缺氧组之间,慢性缺氧组幼鱼脑组织SOD活性较急性缺氧组明显减低,差异有统计学意义4.正常对照组、慢性缺氧组、急性缺氧组缺氧反应相关基因的表达a)慢性缺氧组HIF-1α mRNA的相对表达量是0.674±0.048,急性缺氧组HIF-1αmRNA的相对表达量是1.422±0.136,慢性缺氧组较对照组HIF-1α mRNA的表达水平下调,而急性缺氧组则上调了1.422倍,差异有统计学意义(p<0.05)。b)慢性缺氧组EPO mRNA的相对表达量是0.698±0.079,急性缺氧组EPOmRNA的相对表达量是3.539±0.811,慢性缺氧组较对照组EPO mRNA的表达水平下调,而急性缺氧组则上调了3.539倍,差异有统计学意义(p<0.05)。c)慢性缺氧组p53mRNA的相对表达量是0.724±0.097,急性缺氧组p53mRNA的相对表达量是1.651±0.184,慢性缺氧组较对照组p53mRNA的表达水平下调,而急性缺氧组则上调了1.651倍,差异有统计学意义(p<0.05)5.正常对照组、慢性缺氧组和缺氧复苏组神经特异性基因的表达a)慢性缺氧组nestin mRNA的相对表达量是0.790±0.055,缺氧复苏组nestin mRNA的相对表达量是2.622±0.617,慢性缺氧组较对照组nestin mRNA的表达水平下调,而缺氧复苏组则上调了2.622倍,差异有统计学意义(p<0.05)。b)慢性缺氧组mbp mRNA的相对表达量是0.710±0.060,缺氧复苏组mbpmRNA的相对表达量是1.555±0.0665,慢性缺氧组较对照组mbp mRNA的表达水平下调,而缺氧复苏组则上调了1.555倍,差异有统计学意义(p<0.05)。c)慢性缺氧组syn2a mRNA的相对表达量是0.57±0.126,缺氧复苏组syn2amRNA的相对表达量是0.623±0.037,慢性缺氧组和缺氧复苏组syn2a mRNA的表达水平较正常对照组均下调,缺氧复苏组较慢性缺氧组有所升高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论1.通过将斑马鱼幼鱼置于充入高纯氮气、溶氧量低的水环境中的方法,可建立缺氧性脑损伤模型。2.急、慢性缺氧均可对斑马鱼幼鱼脑组织造成氧化应激损伤,氧化应激是导致斑马鱼幼鱼缺氧后脑组织损伤的机制之一,NO的浓度、MDA的含量以及SOD的活性在氧化应激所致的缺氧性斑马鱼幼鱼脑组织损伤的机制中发挥重要作用。3.急、慢性缺氧时,斑马鱼幼鱼脑损伤的程度不同,慢性缺氧时脑损伤更为严重；急、慢性缺氧时,HIF-1α、EPO、p53基因相关的调控机制可能不同。4.斑马鱼幼鱼缺氧损伤后具有一定的自身修复能力,可能是通过对脑组织nestin基因调控干细胞分化、mbp基因促进髓鞘形成而发挥损伤修复作用。