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研究背景及目的:绝经后骨质疏松(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是一种与雌激素减少相关的全身性代谢性骨病,其特征是骨量减少,骨微观结构受损,骨骼脆性增加,导致骨折发生率增加,严重影响绝经后妇女的健康和生活质量,现已成为一个重要的社会健康问题。骨组织的动态平衡需要成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收共同维持。雌激素水平的降低可导致骨吸收和骨形成之间的平衡被打破,当破骨细胞的骨吸收超过成骨细胞的骨形成时将会导致骨质疏松症的发生,继而引起骨量减少和外伤性骨折的发生。MicroRNA(miRNA)是一类由内源性基因编码的非编码单链小RNA,约有22个核苷酸,通过碱基互补配对与靶基因的3’UTR结合,从而负性调控靶基因的转录和翻译。以往的研究表明miRNAs可以通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化和活性在绝经后骨质疏松的发生发展中发挥重要作用。目前国内外的研究主要集中在miR-218与成骨细胞骨形成之间的关系,然而miR-218对破骨细胞分化的影响机制尚不明确,本研究旨在探讨miR-218对破骨细胞分化的作用和其中的分子机制。材料与方法:首先将RAW 264.7细胞通过RANKL(receptor activator for nuclear factor-κB ligand,核因子-κB受体活化因子配体)诱导分化为破骨细胞,探讨RAW 264.7细胞向破骨细胞分化过程中miR-218表达水平的变化。TRAP染色阳性说明破骨细胞诱导成功。RT-qPCR及Western blot对破骨分化过程中破骨相关的标志性基因NFATc1(nuclear factor of activated T cells 1,活化T细胞核因子1)和TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,肿瘤坏死因子受体相关因子6)的表达水平进行初步验证。接下来,构建miR-218的模拟物(miR-218 mimic),抑制物(miR-218 inhibit)和阴性对照(miR-NC)。在RAW 264.7细胞中分别转染miR-218模拟物,抑制剂或阴性对照,使miR-218过表达或表达抑制,然后加RANKL诱导其破骨分化,研究miR-218对破骨分化的影响。验证miR-218过表达或表达抑制时破骨相关的标志性基因NFATc1和TRAF6的表达水平的改变。采用TargetScan,miRanda和PicTar预测miR-218潜在靶基因,在发现的候选靶基因中,TNFR1(tumor necrosis factor receptor 1,肿瘤坏死因子受体1)的3’UTR有miR-218的结合位点,且TNFR1与破骨分化的信号通路密切相关。在HEK293T细胞中共转染野生型(WT)或突变型(Mut)TNFR1 3’UTR和miR-218,并检测荧光素酶活性,验证miR-218与TNFR1的靶向关系。结果:在RAW 264.7细胞分化为破骨细胞的过程中,miR-218的表达水平下降。当miR-218过表达时将会抑制RAW 264.7细胞向破骨细胞的分化,破骨相关的标志性基因NFATc1和TRAF6的mRNA水平和蛋白水平均显示下降,TRAP染色阳性的细胞计数显著下降。而抑制miR-218的表达则促进RAW 264.7细胞向破骨细胞的分化,破骨相关的标志性基因NFATc1和TRAF6的mRNA水平和蛋白水平均显示上升,TRAP染色阳性的细胞计数显著上升。生物信息学分析TargetScan,miRanda和PicTar预测出的候选基因中TNFR1有miR-218的结合位点且与破骨分化信号通路密切相关。在荧光素酶报告基因实验中,共转染野生型或突变型TNFR1 3’UTR和miR-218时,miR-218可显著抑制野生型TNFR1的表达,但却不能抑制突变型TNFR1的表达。生物信息学分析和荧光素酶报告基因实验均表明,TNFR1是miR-218的直接靶点。结论:研究结果表明,miR-218通过靶向TNFR1抑制其下游NF-κB(nuclear factor-κB,核因子-κB)信号通路,负性调节破骨分化,抑制骨质疏松的发生发展。结果提示靶向miR-218可能成为绝经后骨质疏松症的潜在治疗方案。