近年来,病毒介导方法被逐渐应用于转基因动物生产。病毒载体,包括如逆转录病毒、腺相关病毒和慢病毒等提供了一种可替代性和高效的传递机制。腺相关病毒(AAV)结构简单,无致病性,且可以细小病毒位点特异的方式整合到染色体中。腺相关病毒载体可转染各种组织细胞,包括骨骼肌,并且已被证实在小鼠中没有引起免疫应答。这些特性使AAV系统在病毒来源的基因传递和表达载体中具有很高的生物安全性。卵泡抑制素(FST)已被证实是包括肌肉生长抑制素(MSTN基因)在内的TGB-β家族相关成员的一种有效拮抗剂。MSTN负调控成肌细胞的分化和增殖。最近的一些研究强调了MSTN基因抑制的潜在应用,如在牛上MSTN基因缺失以及小鼠中MSTN基因敲除显示的双肌表型。绵羊作为一种重要的经济动物,双肌绵羊育种具有很高的经济价值。然而,在绵羊上仅有一些关于慢病毒载体介导FST基因的研究,通过AAV表达FST基因还见报道。使用AAV载体生产转基因动物可以增加生物研究安全等级。本研究的目的是构建携带FST基因的重组AAV血清型2 (rAAV2)载体,探讨FST对绵羊原代成肌细胞的体外增殖和分化作用。在本研究中,我们对AAV-2病毒载体携带FST基因可以在体外诱导绵羊成肌细胞分化和增殖的假说进行了验证。主要研究结果如下：1.乌珠穆沁羊原代成肌细胞体外培养。原代成肌细胞采自50-60日龄的绵羊胎儿。培养的细胞具有成肌细胞典型的梭形状形态,生长良好,可用于质粒和腺相关病毒载体转导的后续实验。2.克隆获得Follistatin基因的全长序列,含有一个1035bp,编码344个氨基酸,并进行了测序(GenBank,登录号KF833357)。依据FST的CDS序列,利用NCBI的软件推导其氨基酸序列,并进行氨基酸序列的多重比对。3.在成功克隆绵羊Follistatin基因后,将其连接到真核表达载体pAAV-IRES-GFP质粒中,构建绵羊FST过表达载体pAAV-CFS-FLAG。4.将重组pAAV-CFS-FLAG载体与两个辅助质粒(pAAV-RC和pHelper)共转293细胞,获得AAV病毒颗粒。AAV病毒颗粒以感染复数(MOI)为50,对绵羊原代成肌细胞进行了转染,Western blot结果证实AAV2可以在原代成肌细胞中表达FST蛋白。5.相比对照组,光密度(450nm)在转染的原代成肌细胞中显著增加,这表明FST有显著的增殖。定量PCR结果显示,FST基因过表达使得Akt I和CDK2的表达显著增加,而p2l的表达降低。另一方面,细胞周期分析表明,FST下调CDK抑制剂p21,并提高CDK2在OPM细胞中的表达水平。FST正调节细胞的G1到S期,过表达follistatin基因通过下调p21基因的转录水平,诱导成肌细胞增殖。6.为了进一步开展FST靶基因的功能及鉴定,我们分析了绵羊成肌细胞中ERK1／2信号通路是否也调节FST的表达。结果表明FST过表达充分诱导ERK在细胞中激活。AAV2介导的FST过表达分别导致ERK1和pERK2表达量增加1.7倍和2.3倍(P<0.01)。正如我们的预期,ERK(主要是P42 MAPK)在转染细胞中被充分激活。这些结果表明,通过ERK通路的激活使FST过表达可以诱导细胞增殖。7.对Akt信号转导机制的研究结果表明,FST对ERK1/2和PI3K/Akt通路有调节作用,FST诱导了ERK1/2和Akt的磷酸化,从而促进绵羊成肌细胞的增殖。8.通过吉姆萨染色来确定形成肌小管的细胞核数量,通过形成肌管的细胞核的比例来评价融合效率。在肌管转染AAV-CFS-FLAG的融合率为47.11%,显著高于在非转导细胞中观察到的32.05%,结果表明,在分化培养基中添加FST有助于更多的肌管形成。定量PCR结果也显示,在分化条件下,FST过表达可以促进肌细胞生成素、肌醇D、Myf5、p57和p21 mRNA的表达,但对MSTN和ActRIIB mRNA的表达没有影响。这些研究结果表明,FST在增殖条件下通过上调标记基因诱导细胞增殖。9.本研究中,我们用流式细胞仪检测技术对转基因细胞进行分类排序。经过第一次(3代)和第二次(6代)的分选,细胞阳性率分别达到92.5%和99%。阳性细胞的生长状况良好,Southern杂交结果表明,AAV载体以随机整合的方式插入到基因组位点中,并在FST过表达下促进转基因成肌细胞的增殖和分化。10.FST过表达对处于G1期的转基因细胞有干扰作用。我们对细胞进行碘化丙啶染色后,用荧光激活细胞分类器(FACS)分析细胞周期。染色结果揭示转基因细胞在G0/G1细胞分裂期降低了12%(P<0.01),说明FST过表达降低了细胞的G1期停滞。研究结果还表明aav-fst过表达降低了转基因克隆的G1向S期转化的细胞数。