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本论文主要介绍了在杨树细胞壁多糖链组成及连接方式研究中,一种新的可同时检测醛糖、酮糖和糖醇的基于DMSO系统的环式单糖乙酰化方法的应用。目前的衍生化方法中存在很多问题,酮糖肟化后,由于产生两种顺、反异构体,因此形成两个色谱峰;糖醇乙酰化方法则将一种酮糖还原成为了两种不同的糖醇,影响了醛糖、酮糖和糖醇的检测;硅烷化方法虽然不存在这些问题,但是硅烷化试剂极不稳定,遇水易发生分解,导致反应失败。本研究可以利用二甲基亚砜(DMSO)维持单糖结晶状态的环式构型这一特点,在DMSO中直接乙酰化,这样既可以避免单糖发生变旋现象,又可以衍生化为比硅烷化产物更为稳定的乙酰化产物。
据此,我们分别以23种不同糖为例,首次以DMSO、1-甲基咪唑和乙酸酐为组合,对单糖乙酰化产物进行气相色谱四级杆质谱(GC/DSQMS)分析比较。结果表明,23种单糖峰形唯一,实现天然构型的醛糖、酮糖、糖醇、糖胺和双糖的同步分析。此外,我们还对可溶性单糖的前处理方法(鲜样、烘干和冻干)、提取方法(提取液、80%甲醇和DMSO提取)和衍生化方法(肟化乙酰化、还原乙酰化和DMSO中乙酰化)进行了三因素三水平的极差和方差分析,结果表明鲜样提取、DMSO提取和DMSO中直接乙酰化的组合是最佳组合。
利用DMSO维持单糖结晶状态的环式构型这一特点,应用于单糖标样的随机衍生化和多糖的甲基化乙酰化分析,既避免了将高氧化态的单糖还原为糖醇导致的多种单糖色谱峰相互叠加问题,又避免了还原将单糖环式结构打开增加了连接位点数,增加了色谱质谱分析困难的问题,同时又减少了实验的操作步骤。
我们以植物细胞壁结构中常见的7种醛糖为研究对象,构建了植物细胞壁结构组份多糖中常见单糖的随机甲基化乙酰化质谱图库,共获得并解析7种单糖的随机甲基化乙酰化质谱185幅,其中六碳糖吡喃式随机甲基化-乙酰化单糖质谱图80幅,为理论值的80/87;六碳糖呋喃式随机甲基化乙酰化单糖质谱图41幅,为理论值的41/87;五碳糖吡喃糖随机甲基化-乙酰化单糖质谱图34/35,覆盖率达(97.14%);五碳糖呋喃糖随机甲基化-乙酰化单糖质谱图30/35,覆盖率达到了(85.71%)。共发现185种单糖衍生物(理论值为196种)。并构建完成了相应的植物细胞壁结构单糖质谱指纹图谱库,其裂解模式可分为6种途径。
结合自建的单糖随机甲基化-乙酰化产物质谱图库,对典型多糖糖链连接位点研究方法进行摸索,并成功的解析了典型多糖糖链的链接位点。并用该方法对杨树不同器官组织细胞壁结构组份多糖进行了连接位点的解析,初步揭示了杨树细胞壁组份中的多糖果胶和半纤维素的单糖连接方式。
在完成细胞壁单糖指纹图谱库构建、杨树细胞壁结构多糖单糖组份分析及单糖间连接方式解析的基础上,试图对不同进化阶段的蕨类植物(5种)、裸子植物(9种)、双子叶植物(11种)和单子叶植物(7种),共32种植物叶片细胞壁结构组份木质素、纤维素、果胶和半纤维素的组成与比例进行了分析,并对果胶和半纤维素中的中性单糖进行解析。
研究结果表明,木质素含量从蕨类植物到裸子植物呈上升趋势,但随着进化程度的增高,单子叶植物中木质素含量比双子叶植物降低。在本研究中,酸性单糖随着进化程度的增高,含量呈逐渐上升趋势。酸性单糖是果胶的主要组成成分。在果胶组分中性单糖组分分析中,随着植物进化程度的增高,鼠李糖呈现逐渐增高的趋势,阿拉伯糖呈现逐渐下降的趋势。在半纤维素组分中,随着植物进化程度的增高,木糖变化较为明显。木糖由蕨类植物中的40%左右,逐渐增加到单子叶植物中的80%,这种情况可能与木聚糖逐渐成为半纤维素主要多糖参加细胞壁与细胞协调生长、支撑和保护细胞有直接关系。