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H7N9流感病毒自2013年出现以来,截止至2020年5月,引起了1568人感染,对公共卫生安全产生了巨大的威胁,并且不断地危害禽养殖业,造成了巨大的经济损失。尽管已有大量研究揭示了H7N9流感病毒的流行病学特征、跨种间传播机制等,但其对哺乳动物及家禽的的致病机理尚不明确。为深入研究H7N9禽流感病毒的致病机理,本研究选取两株对哺乳动物和鸡致病性具有明显差异的H7N9流感病毒A/chicken/Guangdong/SD008/2017（简称CK/SD008）与A/chicken/Guangdong/SD008/2017（PB2/627K）（简称CK/SD008-PB2/627K）作为模式病毒株构建荧光蛋白报告病毒,并利用报告病毒对初步研究了H7N9病毒在小鼠体内的感染特性和GSDME分子对H7N9流感病毒复制的影响。首先在CK/SD008病毒的NS基因片段上插入Venus或Apple报告基因,构建重组质粒pHH21-NS-Venus和pHH21-NS-Apple。利用12质粒反向遗传操作系统,构建了SD008-627E-Venus、SD008-627E-Apple和SD008-627K-Venus、SD008-627K-Apple 4株荧光报告病毒。将报告病毒经鸡胚传2代、小鼠体内传3代后感染A549细胞,后经倒置荧光显微镜观察。结果显示4株报告病毒感染的细胞均有荧光蛋白的表达。将4株报告病毒与亲本病毒感染C57BL/6小鼠进行致病性实验,结果显示4株报告病毒的小鼠半数致死剂量(MLD50)及脏器病毒含量与亲本病毒没有统计差异。用小鼠适应性报告病毒SD008-627K-Venus（mSD008-627K-Venus）感染MDCK细胞,经倒置荧光显微镜及肉眼观察和统计荧光斑以及空斑个数,结果显示荧光斑个数与空斑个数无差异。用mSD008-627K-Venus感染小鼠,3 d后取其肺脏细胞经流式实验检测CD45和CD11b阳性和阴性细胞中荧光病毒的感染情况。结果显示感染小鼠肺部白细胞（CD45+）增多,其中趋化的白细胞中主要为CD11b+的白细胞,报告病毒主要感染实质细胞（CD45-）,感染免疫细胞（CD45+）的数量很小。上述结果表明,构建的报告病毒具有良好的遗传稳定性并与亲本毒株具有一致的致病性,荧光表达稳定,可用于H7N9禽流感病毒感染及致病机理相关的研究。剪切的GSDME分子具有膜结合特性,决定细胞死亡的方式。为研究GSDME分子影响H7N9流感的复制及其作用机制,本研究构建了GSDME分子敲低的A549细胞系和过表达RAW264.7细胞系,用H7N9荧光报告病毒mSD008-627K-Apple株分别感染A549细胞和RAW264.7,用流式细胞术实验检测感染效率,用激光共聚焦对感染细胞内GSDME进行定位分析,用western blotting与荧光定量方法检测细胞核内病毒PB2及NS1的表达。结果显示:敲低GSDME分子后能显著降低病毒对A549细胞的感染,而过表达GSDME分子能显著增加病毒对RAW264.7细胞的感染;H7N9病毒感染A549细胞后活化的GSDME N端结构分布在核膜上;敲减GSDME分子后,能明显减少病毒基因组入核,降低病毒NS1蛋白和PB2蛋白的表达。上述结果表明,GSDME分子促进H7N9流感病毒复制过程,且分布于核膜上的GSDME分子影响流感病毒PB2基因在细胞核内的含量。本研究成功构建了4株H7N9报告病毒,报告病毒对小鼠的感染性和致病性与亲本病毒相似;用报告病毒研究GSDME分子对H7N9流感病毒复制分子机制,发现GSDME可以通过调控流感病毒基因组入核促进病毒复制。本研究为下一步H7N9流感病毒的致病机制研究提供了有力工具和新的线索。