高血压病是人类最常见的慢性疾病之一,在全世界都有较高的发病率。据卫生部2009年数据显示,我国居民高血压患病率持续增长,现有高血压患者估计达2亿人。高血压发病机理比较复杂,没有统一的观点,相关研究发现抑制血管紧张素转移酶(ACE)的活性可以有效的降低高血压患者的血压。但目前临床上广泛使用的化学合成类ACE抑制剂药物,长期服用后副作用明显。而来源于食物蛋白的ACE抑制肽因其食源性及无副作用的特点引起了人们的极大关注,成为目前多肽研究的热点之一。　　 乳蛋白不仅是膳食蛋白质的重要来源,来源于乳蛋白的生物活性肽的也备受关注。乳源性生物活性肽按功能可分为降血压肽、类吗啡活性肽、抗菌肽、免疫活性肽等。目前乳源性降血压肽制备的方法主要有蛋白质酶水解法和发酵法,但都存在天然原料高活性降血压肽含量低、水解产物复杂、分离纯化环节多、产量低和产品成本高等问题,严重制约了降血压肽的产业化。利用基因工程技术生产降血压肽不受原料来源限制,生产周期短,下游分离纯化工艺简单,是克服上述困难、进行大规模生产的重要途径,具有广阔的应用前景。　　 具有高活性的乳源蛋白酶解产物通常为多肽混合物,包含了多种具有不同作用机理的高活性多肽成分,利用工程菌仅仅表达其中单一活性肽可能达不到很好的降血压效果。本研究将含两种具有不同作用机理的乳源性降血压肽(CEI12(Phe-Phe-Val—Ala-Pro-Phe-Pro-Glu—Val-Phe-Gly-Lys)和CEI7(Ala-Leu—Pro-Met-His-Ile-Arg))的3串联基因克隆至pET-30a载体,将重组的pET-30a载体转入大肠杆菌BL21,获得能表达降血压肽重组蛋白的工程菌。　　 在工程菌胞内表达的重组蛋白以不溶性的包涵体存在,只有经过充分的细胞破碎,才能进行有效的提取。对细胞破碎方法进行了研究,发现探索得到的超声辅助法明显优于传统的Ni-柱亲和纯化法。得出最佳的纯化工艺为:反复冻融破碎细胞5次,然后将破碎处理的菌体加入3 mL细胞裂解缓冲液Ⅰ使菌体重悬浮,超声破碎2 min,8000 rpm离心后取沉淀。将沉淀重悬浮于4℃、10 mL细胞裂解缓冲液Ⅱ,室温放置5 min,4℃、8000 rpm离心后取沉淀。将沉淀悬浮于10 mL去杂液,室温放置5 min,进行超声处理30 s,4℃、8000 rpm离心后取沉淀,即为纯化后的重组蛋白。　　 麦胚是小麦加工的廉价副产品,其蛋白质含量达30％左右,并且含有较多疏水性氨基酸,适合工程菌发酵表达富含疏水性氨基酸的重组降血压肽。本研究以麦胚水解物作为发酵培养基的基础原料,确定适合工程菌生长和融合蛋白表达的麦胚培养基配方,并在此培养基的基础上优化诱导条件。优化后的培养基配方为:酵母粉质量分数0.5％,麦胚酶解物质量分数2％,葡萄糖质量分数0.5％,NaCl质量分数0.5％。在优化后的培养基基础上最佳的工程菌IPTG诱导条件为:诱导温度为32℃,诱导起始OD600为1.4,诱导时间为10 h。在优化后的培养基和诱导条件下,纯化的包涵体含量达到535 mg／L,比2×YT进口培养基的表达量提高了18％。　　 对纯化的重组蛋白,加入肠激酶酶解去除N端的His融合标签,切下的His融合标签利用Ni-柱亲和吸附去除,制得去融合标签的串联多肽。将所得到的串联多肽溶液加入胰蛋白酶,酶切后释放出降血压肽单体,通过截留分子量7000 Da的透析袋去除肠激酶和胰蛋白酶,透过液经浓缩后用CELLUFINE GH-25柱脱盐得到纯化的乳源性降血压肽,经检测CEI12和CEI7混合多肽的表达量为0.14 g／L。　　 对乳源性降血压肽的稳定性和活性进行了研究,研究得出乳源性降血压肽的IC50值为0.012 g／L,活性高于文献报道的CEI12和CEI7单一成分的活性,并且具有良好的抗肠道消化酶消化的能力,且经过蛋白酶消化后活性还略有上升。此外,乳源性降血压肽还具有良好的热稳定性、耐酸碱性,处理3h其ACE抑制活性仍为初始值的81％以上。原发性高血压大鼠动物实验显示,高剂量组(0.8 g／kg)在一次性灌胃6 h后,收缩压下降值达到32 mmHg左右,阳性对照(卡托普利)血压下降至38 mmng,说明乳源性降血压肽对原发性高血压大鼠良好的降血压效果。