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目的:本研究拟通过建立糖尿病周围神经病变大鼠模型,模拟出与气虚血瘀表征相对应的证候模型,通过对模型组血浆标本的代谢组学研究,寻找糖尿病周围神经病变气虚血瘀证病变的特征性代谢产物,分析代谢产物变化规律,探讨其不同代谢途径对生理病理相关改变的作用机理,探寻糖尿病周围神经病变气虚血瘀证的分子变化机制,从而进一步揭示糖尿病周围神经病变气虚血瘀证的证候本质。同时运用代谢组学的技术与方法,从机体内源性代谢物的角度阐释木丹颗粒的治疗糖尿病周围神经病变机制及作用靶点,为中药治疗糖尿病周围神经病变作用机理的系统研究提供科学依据。材料与方法:1动物疾病模型的制备选取健康雄性SD大鼠体重(180士20)g共40只,按随机数字表法随机分成两组:空白对照组(n=10)和模型组(n=30)。空白对照组常规基础饮食,模型组给予高糖高脂饲料喂养,共8周。造模前禁食12小时,模型组给以一次性腹腔内注射链脲佐菌素溶液(Streptozotocin,STZ)诱发糖尿病。72小时后通过血糖仪测定大鼠尾静脉血血糖,血糖大于16.7mmol/L者列入观察对象,正常对照组大鼠一次性腹腔注射相等容积0.1mol/L枸椽酸缓冲液。然后模型组单日喂食甘蓝15~20g/只,并放于水槽中游泳至出现半数以上沉降;双日持续高糖高脂饲料喂养,共4周,建立符合糖尿病周围神经病变的气虚血瘀证模型。观察并记录大鼠的一般状态、气虚血瘀证的生物表征、血糖、甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白变化情况,测定大鼠神经传导速度、热板舔足间隔时间及血液流变学异常改变的相关指标,动物解剖经电镜光镜确认模型大鼠神经细胞出现变性坏死的病理性改变。所有实验数据均采用IBM SPSS Statistics 19软件进行统计学分析。各组实验数据采用均数±标准差(sx±)表示。各组数据平均数之间的差异采用单因素方差分析。P<0.05时判定有显著性差异,P<0.01被认为有非常显著性的差异。2对糖尿病周围神经病变大鼠模型的代谢组学研究随机选取制备成功的糖尿病周围神经病变气虚血瘀证模型组(n=7)和空白组(n=7)大鼠血浆样品进行分析,按质量数生成总离子流数据(Total Ion Chromatogram,TIC)经Masslynx V4.1工作站进行峰匹配、峰对齐、归一化等处理后,导入SIMCA-P11.5(umetrics,umea,sweden)软件中,运用主成分分析(pca)等方法,产生得分矢量图(scoreplot)用以获得样品分类信息,载荷矢量图(loadingplot)用以发现潜在的生物标志物,通过代谢标记物的一级和二级质谱信息,结合数据库检索、查阅文献和对照品确证,完成基于uplc-ms的大鼠血浆代谢标记物谱中代谢物的鉴定,并追溯其来源和代谢途径。首先,根据保留时间和质荷比,在总离子流色谱图中提取得到代谢标记物的提取离子色谱峰。第二步,通过提取离子色谱峰得到代谢物的一级质谱图,找到其准分子离子和相关离子,确定代谢物的分子量。第三步,对代谢标记物进行二级质谱扫描,获得代谢物的结构信息。第四步,利用国内外相关代谢组学标志物在线数据库,通过代谢物的分子量进行检索,得到若干候选化合物。比较代谢物的二级质谱信息,去除不相关的化合物,完成代谢物的鉴定。第五步,参照可以获得的对照品,在相同的实验条件下分别对血浆样品和对照品进行分析,通过比较二者的保留时间、一级和二级质谱信息对鉴定结果进行确证。3对糖尿病周围神经病变大鼠应用木丹颗粒干预后的代谢组学研究将制备成功的糖尿病周围神经病变气虚血瘀证大鼠按随机数字表分为两组:模型组(n=7)和中药组(n=7)。根据临床患者每日中药服用剂量换算成大鼠的每日等效剂量为4.375g/kg,中药组大鼠每天灌胃二次,连续4周。通过uplc-ms技术检测,观察糖尿病周围神经病变气虚血瘀证模型经木丹颗粒治疗干预后,血浆中小分子代谢物组的差异性变化趋势,并对大鼠血浆uplc-ms代谢物谱分析方法系统稳定性进行验证,同时考察仪器精密度、实验方法可重复性、血浆样品及系统的稳定性。结果:1.造模开始后,模型组大鼠逐渐出现游泳半数沉降间隔时间缩短,耐力逐日下降,进食减少,倦怠懒动,精神萎靡不振,体毛光亮度减退,粪便时软时溏,或便次增多,4周后模型组大鼠开始出现耳部血管脉络扩张充血,口唇周围发黑、爪尾部紫暗等瘀血症状。2.8周后模型组甘油三酯、低密度脂蛋白、总胆固醇和高密度脂蛋白分别出现异常改变,造模结束后模型组出现血糖升高,动物解剖经电镜光镜分析提示变性坏死及神经脱髓鞘改变,舔足间隔时间延长,神经传导速度减慢,血液流变学改变。3.通过uplc-ms进行血浆代谢物谱研究在空白组及模型组均可发现精氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,胆酸及lpc,与空白组大鼠相比,模型组大鼠血浆中精氨酸,色氨酸,胆酸和溶血磷脂酰胆碱(lpc)18:2的水平显著升高;苯丙氨酸,lpc18:0,lpc18:1和lpc18:2的水平显著降低。提示这几种物质在糖尿病糖尿病周围神经病变气虚血瘀证大鼠血浆中存在异常改变,可能为与糖尿病周围神经病变气虚血瘀证相关的生物标记物。4.通过uplc-ms进行血浆代谢物谱研究发现,与模型组大鼠相比,中药组大鼠血浆中色氨酸,lpc(20:4)和pc(36:4)的水平显著升高;苯丙氨酸,lpc(14:0),lpc(16:0/0:0),lpc(0:0/18:0),lpc(18:0/0:0),lpc(18:1),lpc(0:0/18:2),lpc(18:2/0:0)和胆酸的水平显著降低。提示这几种物质在应用木丹颗粒干预治疗糖尿病周围神经病变气虚血瘀证大鼠后其血浆中的含量发生改变,可能为木丹颗粒治疗糖尿病周围神经病变的机理提供新的依据。结论:1.本实验运用病证相结合的方法,引入“生物表征”的评价指标,在采用中医研究中较为公认的劳倦内伤“半数沉降”的方法制备气虚血瘀模型的基础上,结合注射链脲佐菌素建立符合糖尿病周围神经病变相关病理指标模型,结果较为成功的建立出糖尿病周围神经病变气虚血瘀证的动物模型。既符合糖尿病周围神经病变的判定标准,同时也具有气虚血瘀模型表征的生物学特征。2.实验中发现精氨酸,苯丙氨酸,色氨酸,胆酸及多种lpc等物质可能为糖尿病周围神经病变气虚血瘀证大鼠特征性的代谢产物,对应用代谢组学方法早期糖尿病周围神经病变的诊治提供了新的思路。3.通过对实验模型组大鼠血浆代谢标志物代谢途径及作用机制的研究分析可知糖尿病周围神经病变发病机制可能是下列因素共同作用的结果:大脑内单胺类神经递质5-羟色胺(5-ht)调节异常;多巴胺(da)或去甲肾上腺素(ne)合成减少,而同时生成假性神经递质羟苯乙醇胺和苯乙醇胺,影响神经系统的正常功能;苯丙氨酸代谢异常导致维生素b12缺乏;血管舒缩功能异常、血管通透性改变,内皮功能损伤,一氧化氮(no)合成和释放减少,na+-k+-atp酶活性降低,氧自由基损伤,氧化应激,血管炎症反应增加;糖脂代谢异常改变。4.木丹颗粒通过多种途径、不同靶点、双向调节等方式对糖尿病周围神经病变进行干预治疗。不仅能使色氨酸,lpc(20:4)和pc(36:4)水平显著升高;同时也使苯丙氨酸,lpc(14:0),lpc(16:0/0:0),lpc(0:0/18:0),lpc(18:0/0:0),lpc(18:1),lpc(0:0/18:2),lpc(18:2/0:0)和胆酸的水平显著降低。通过用药干预后下游的代谢标志物出现的趋势特点推测出木丹颗粒作用机制。5.采用超高液相色谱质谱联用技术的代谢组学方法是研究病证结合的中医动物模型有效手段之一,同时根据分析糖尿病周围神经病变代谢产物的变化规律推测出其可能的发病机制,对于糖尿病周围神经病变及相关中药机理研究建立了良好的平台。