外泌体(exosome)是一类直径为30-150 nm的脂质双层膜结构囊泡,参与细胞通讯,特别是肿瘤来源的外泌体(tumor derived exosomes,TDEs)与肿瘤的发生发展及复发转移密切相关,作为肿瘤标志物的价值得到越来越多的重视。然而传统的外泌体研究策略反映的是细胞群体平均水平,掩盖了单个细胞的行为和反应过程,尤其肿瘤异质性会对肿瘤精准治疗造成了巨大障碍。近年来微流控芯片的快速发展,使外泌体的分离与检测更加快速、通量更高、试剂与样品消耗更低,同时能够用于单细胞研究的液滴微流控技术也具有广阔的应用前景。因此本研究针对肿瘤单细胞外泌体检测的需求,开发了一款基于液滴的微流控芯片,集单细胞捕获、培养和外泌体检测于一体。主要研究内容如下:1)设计并制备了一种生成油包水型液滴的微流控芯片,由PDMS模块和培养皿键合而成。通过设计2个分散相入口和1个连续相入口,有利于细胞和磁珠同时被液滴包裹,磁珠得以捕获细胞分泌的外泌体;通过螺旋形通道使得细胞惯性聚焦,有助于单细胞包裹;通过十字形流动聚焦结构,使生成的液滴更加稳定均匀;通过与培养皿键合,实现单细胞在液滴中的培养。2)研究了各项因素对液滴大小和单细胞包裹率的影响,最终确定了最佳的进样条件:使用氟化油作连续相时,两相通道的高与宽均为50μm,Matrigel浓度为20%,细胞浓度为1-1.2×10~6个/mL,磁珠浓度为1×10~7个/mL时,对应的分散相压强为0.02 MPa,连续相压强为0.01 MPa。由此生成的液滴平均直径为100μm,单细胞包裹率平均为20%,同时多细胞包裹率在5%以内。通过在细胞悬液中添加Matrigel,使液滴在细胞培养环境下凝胶化,加固液滴形态,避免液滴融合的发生,最终成功实现了细胞在液滴内的长达2周的培养。3)分别利用SEM、ELISA和免疫磁珠法捕获并检测细胞上清与临床血清样本中外泌体的大小、形态,通过荧光强度来表示外泌体及相应蛋白的表达量。结果表明通用染料Di I细胞膜荧光探针灵敏度比较高,利用Di I对培养7天的液滴进行荧光成像,发现捕获外泌体的磁珠具有荧光信号,成功实现了对单细胞外泌体的捕获及初步检测。后续需要进一步对单细胞分泌外泌体进行分型检测。综上所述,本研究设计了一款液滴微流控芯片并搭建了进样平台,构建了一套液滴内单细胞培养方法,并初步完成了单细胞外泌体检测。对单细胞外泌体进一步分型检测提供基础,为肿瘤异质性研究提供依据。