研究背景多发性硬化(MS)是中枢神经系统脱髓鞘性疾病,是青年人常见致残的神经系统疾病之一。髓鞘再生失败和轴突损害是MS患者遗留永久神经功能损害的病理基础,其中反复的髓鞘脱失可以导致轴突损伤。故尽快修复髓鞘,是防止轴突损害和减少残疾发生的关键。赖氨酸重复序列和免疫球蛋白结构域(Leucine rich repeat and Ig domain containing1, Lingo-1)是中枢神经系统成髓鞘细胞(少突胶质细胞)分化成熟的负性调控因子。EAE是目前公认的广泛应用于研究的多发性硬化动物模型。本研究通过RNA干扰抑制Lingo-1表达,观察Lingo-1抑制对少突胶质细胞和EAE的影响并探讨其机制,为下一步多发性硬化Lingo-1阻断治疗做一些有益的尝试。本研究分三部分。第一部分Lingo-1shRNA慢病毒载体的构建及筛选目的：筛选出对小鼠少突胶质细胞Lingo-1表达沉默效率较高的Lingo-1shRNA慢病毒载体。方法：1.体外原代培养少突胶质细胞,取材自新生48h内小鼠大脑皮质；应用不同分离纯化方法后测定细胞存活率和纯度,摸索较为理想的细胞获取方法；并进行Lingo-1、MBP免疫荧光鉴定。2.将编码Lingo-1shRNA慢病毒载体转导少突胶质细胞后,对转导后的细胞行MTT细胞增殖实验,观察转导对细胞生存的影响。3.转导后96h应用RT-qPCR方法检测了Lingo-1mRNA水平的变化；应用Western blot方法检测Lingo-1蛋白质水平的变化；应用免疫细胞荧光,观察转导后少突胶质细胞上Lingo-1的表达并计数细胞Lingo-1阳性率；筛选出抑制效果最佳的Lingo-1shRNA慢病毒载体。结果：1.原代培养的小鼠少突胶质细胞经轻度胰酶消化+短时间振荡法和振荡分离法两种不同分离纯化方法细胞纯度相近(P>0.05),但轻度胰酶消化+短时间振荡法细胞存活率更高(96.46+2.26%vs80.25+1.55%,P<0.05)。培养细胞经Lingo-1、MBP免疫细胞荧光染色鉴定为阳性。2.MTT实验显示Lingo-1shRNA慢病毒转导少突胶质细胞后,干扰组与正常组少突胶质细胞OD值间没有显著差异(P>0.05)。3.少突胶质细胞转导Lingo-1shRNA慢病毒96h后,LV/Lingo-1shRNA(1)组和LV/Lingo-1shRNA(2)组Lingo-1mRNA的沉默效率分别为36%和37%,明显高于其它组(P<0.05, P<0.05); LV/Lingo-1shRNA(1)组和LV/Lingo-1shRNA(2)组Lingo-1蛋白的沉默效率分别为27.6%和28.3%,明显高于其它组(P<0.05,P<0.05)；免疫细胞荧光染色也显示LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)组Lingo-1蛋白含量明显减少。结论：LV/Lingo-1shRNA(1)和LV/Lingo-1shRNA(2)为较高沉默效率的慢病毒载体,且对细胞生存率无明显影响。LV/Lingo-1shRNA(2)用于后续的RNA干扰研究。第二部分Lingo-1shRNA慢病毒载体对少突胶质细胞的影响目的：探讨Lingo-1shRNA慢病毒载体对小鼠少突胶质细胞的影响。方法：1.应用抑制效果最佳的LV/Lingo-1shRNA (2)转导少突胶质细胞,应用RT-qPCR、 Western blot方法检测转导后第1、3、7、14天Lingo-1mRNA和蛋白的表达,并和空白对照组、阴性对照组比较,观察LV/Lingo-1shRNA(2)在不同时间的沉默效率。2.应用Western blot方法检测转导后第1、3、5、7天少突胶质细胞MBP蛋白表达；应用细胞免疫荧光,计数转导后不同时间少突胶质细胞MBP阳性率,了解Lingo-1shRNA慢病毒载体对少突胶质细胞分化成熟过程的影响。3.应用Western blot方法检测p-RhoA蛋白质水平的变化,探讨Lingo-1shRNA的可能作用通路。结果：1.少突胶质细胞转导LV/Lingo-1shRNA(2)后第3、7、14天,干扰组的Lingo-1mRNA的沉默效率为13.2%、45.1%和57.0%,显著高于对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.05)；第3、7、14天,干扰组的Lingo-1蛋白的沉默效率为27%、47%和53%,显著高于对照组(P<0.05,P<0.01,P<0.01)。2. LV/Lingo-1shRNA (2)干扰后第1天、第7天少突胶质细胞MBP蛋白与对照组相比无显著差异,第3天和第5天MBP蛋白的表达显著增加(2.29±0.13vs1.23±0.08)(2.64±0.21vs1.31±0.11)(P<0.01, P<0.01)。LV/Lingo-lshRNA(2)干扰后第1天干扰组MBP阳性率为(45.4±5.5)%,与空白对照组无明显差异(P>0.05)。第3、5天干扰组MBP阳性率分别为(89.7±7.9)%和(99.6±4.6)%,明显高于对照组(P<0.01,P(0.05)。3. LV/Lingo-1shRNA(2)干扰后24h、48h、72h、96h,干扰组和空白对照组之间p-RhoA蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论：LV/Lingo-1shRNA对少突胶质细胞中Lingo-1的沉默效率在一定时间内呈逐渐增强趋势。沉默Lingo-1促体外培养的少突胶质细胞更早更快成熟。第三部分沉默Lingo-1基因表达对自身免疫性脑脊髓炎的影响目的：探讨沉默LINGO-1表达对EAE小鼠运动功能和髓鞘恢复的影响。方法：1.建立EAE小鼠模型,通过RT-PCR、Western-Blot方法,检测了造模成功后第1、3、7、14、21、30天脑组织内Lingo-1的变化,并和正常小鼠比较。2.造模成功评分在2-3分之间的EAE小鼠,随机分为5组：侧脑室注入5ul滴度为5×109Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA(2)组,侧脑室注入5ul滴度为5×108Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA(2)组,侧脑室注入5ul滴度为5×107Tu/ml LV/Lingo-1-shRNA (2)组,侧脑室注入5ulLVCON053组和未治疗组；通过RT-PCR、Western-Blot方法,检测转导后不同时间各组脑组织内Lingo-1的变化。3.对不同组的EAE小鼠进行运动功能评分及髓鞘快蓝染色,探讨侧脑室注入Lingo-1shRNA慢病毒载体对EAE小鼠运动功能恢复及髓鞘形成的作用。结果：1.小鼠多在诱导后7-10天左右发病,总发病率为81.3%,平均临床评分为2.45±0.94分。EAE模型组小鼠造模成功第1、3、7、14、21天LINGO-1mRNA和蛋自表达较对照组和佐剂组有明显上调,LINGO-1蛋白表达在第7天上调最为明显(P<0.01),其后逐渐下降,至第30天时仍略高于对照组。EAE小鼠LINGO-1mRNA的峰值则出现在第1天,第30天其值接近对照组(P>0.05)。2.在LV/Lingo-1-shRNA注入后第3天开始,5×107、5×108和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组Lingo-lmRNA表达明显降低(2.45±0.15,2.06±0.18,2.14±0.08vs2.80±0.10,P<0.05)；在第14天5×108和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组Lingo-1mRNA已降至接近于正常水平(1.19±0.11,1.46±0.10vs1.03±0.09, P>0.05,P<0.05)。5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组在第30天Lingo-1mRNA表达也接近于正常值(1.25±0.06vs1.03±0.12,P>0.05)。在Lingo-1蛋白表达方面,5×107、5×108和5×109LV/Lingo-1-shRNA组EAE小鼠从第7天开始均有明显下调(2.53±0.10,1.99±0.13,2.08±0,10vs3.14±0.06, P<0.05, P<0.01, P<0.01),第21天5×108和5×109LV/Lingo-1-shRNA组Lingo-1蛋白已降至接近正常水平(1.14±0.10,1.15±0.03vs1.01±0.03,P>0.05,P>0.05)。3.侧脑室注射LV/Lingo-1shRNA (2)后,相比较于LVCON053组和未治疗组,5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA、5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA和5×109TU/mlLV/Lingo-1-shRNA三组从第7天开始运动功能评分有不同程度的下降(3.11±0.13,2.42±0.13,2.96±0.10vs3.56±0.15,3.87±0.12,P<0.01,P<0.01, P<0.05)。其中,5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组运动功能改善最明显。4.侧脑室注射LV/Lingo-1shRNA (2)后第30天,5×107TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组和5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组髓鞘密度明显高于未治疗组(P<0.05,P<0.01),其中5×108TU/mlLV/Lingo-1-shRNA组髓鞘修复最佳,但仍未达正常水平(P<0.05)。结论：侧脑室注射LV/Lingo-1shRNA是一种沉默EAE小鼠脑内Lingo-1表达的有效方式。Lingo-1下调可改善EAE小鼠运动功能及促髓鞘修复,但效果并不随LV/Lingo-1-shRNA剂量增加而增强。