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背景:网膜素是一种新型脂肪因子,也被称为肠凝集素-1(Intelectin-1,ITLN-1)。ITLN-1不仅与肥胖症、糖尿病等疾病关系密切,其在抗炎症、抗动脉粥样硬化、抑制肿瘤细胞增殖中的突出作用也得到众多科研工作者的关注。有研究表明缺血性脑卒中稳定斑块组患者血清的ITLN-1水平高于不稳定颈动脉斑块组。不同个体间的ITLN-1水平具有着明显差异。ITLN-1在人内皮细胞、网织红细胞以及结肠、卵巢、肺和胎盘等组织中均有不同程度的表达,但在皮下脂肪中检测不到。因此研究人ITLN-1基因的转录调控机制将有重要的研究意义。DNA pull down是一种基于DNA短片段拥有对DNA结合蛋白的高亲和力位点并借助生物素/链霉亲和素纯化系统开发出的一种技术,广泛应用于DNA-蛋白质相互作用的研究中。目的:为进一步探索ITLN-1在表达过程中受到的转录调控机制,我们使用前期实验确定出的ITLN-1核心启动子区序列为DNA探针进行DNA pull down实验。对结合在该序列的蛋白质进行富集,结合生信分析筛选出转录因子,通过小干扰RNA和双荧光素酶报告基因实验初步确定出该转录因子对ITLN-1表达的影响。方法:1.依据ITLN-1的核心启动子区域设计引物,并进行生物素标记;通过PCR技术获得目的基因,利用琼脂糖凝胶电泳对其进行纯化并回收,即获得目的探针;利用DNA Pull down技术对细胞核蛋白进行下拉,下拉产物经过SDS-PAGE后银染,选择差异性条带进行质谱检测;通过生物信息学网站分析数据,筛选出转录因子;2.根据初步筛选出的转录因子设计siRNA,对其进行特异性敲低,并通过qPCR检测该转录因子敲低后对ITLN-1基因表达的影响;3.将表达该转录因子基因的CDS区构建入质粒与搭载ITLN-1核心启动子区域的质粒共同转入HEK293T细胞,48h后进行双荧光素酶活性检测,确定出过表达该转录因子对ITLN-1核心启动子区域转录的影响。结果:1.根据ITLN-1核心启动子区域合成的目的探针与阴性探针相比,通过DNA pull down下拉了72个差异性蛋白质。通过富集分析得知其中有32个蛋白质的主要生物学功能与核酸结合相关。通过数据库检索得知KDM5A、ENO1、HSP90AA1、PNN、PRPF6、CHD5与转录相关。选择在文献报道中以转录因子身份出现的KDM5A进行下一步研究。行Western blot检测到KDM5A在目的探针DNA pull down产物中差异性表达;2.使用两条针对KDM5A的siRNA(siKDM5A-1、siKDM5A-2)分别转染HEK293细胞,发现siKDM5A-1的干扰效率达到70%以上,siKDM5A-2的干扰效率低于70%;当使用siKDM5A-1敲低KDM5A后ITLN-1的表达出现上调;3.将pGL3_basic、pcDNA3.1、pRL、pcDNA3.1-KDM5A、pGL3_ITLN1-1行不同组合转染HEK293T细胞,转染后48h裂解细胞进行双荧光素酶报告基因检测。共转染pcDNA3.1-KDM5A和pGL3_ITLN1-1的细胞,其RLU值显著高于其他组。结论:1.针对ITLN-1启动子核心区域成功合成了具有生物素标记的目的探针,确定出KDM5A、ENO1、HSP90AA1、PNN、PRPF6、CHD5等六个与转录相关的蛋白质结合在该区域;2.在HEK293细胞中将KDM5A敲低后,ITLN-1在mRNA水平的表达出现上调。KDM5A的过表达可促进ITLN-1核心启动子区的转录;3.KDM5A作为组蛋白去甲基化酶参与对ITLN-1的基因沉默,但以非去甲基化酶依赖的特点增强ITLN-1核心启动子的转录。