黄花棘豆的遗传结构及苦马豆素和内生菌的关系研究

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黄花棘豆是草原毒害草棘豆属的一种,广泛分布于我国西北、西南地区的牧区草原。其在我国的分布范围呈逐年扩大态势,在美国已将棘豆属植物列为草原入侵种。黄花棘豆因其全株内含有吲哚西啶生物碱-苦马豆素,当家畜大量采食黄花棘豆并在体内蓄积到家畜体重的0.1%时,会产生中毒、流产、严重者导致死亡。黄花棘豆内含有内生菌Undifilum oxytropis,而内生菌的次生代谢产物中有一种为苦马豆素,属于植物毒素。因此,研究黄花棘豆的遗传结构及苦马豆素与内生菌三者之间的关系,可以为遏制黄花棘豆在我国草地的大范围蔓延和扩张提供新的手段和方法。本文主要进行了以下几方面的工作:第一部分,是利用微卫星分子标记技术对我国黄花棘豆的33个居群,进行遗传结构和遗传多样性的分析,并预测黄花棘豆可能在我国的拓殖路线。第二部分,利用高效液相色谱法对黄花棘豆居群内所含苦马豆素含量进行测定。第三部分,使用实时荧光定量PCR技术及限制性内切酶对每个居群的内生菌进行定量检测。第四部分,基于前三部分实验的结果,对黄花棘豆的遗传结构、苦马豆素和内生菌三者之间进行相关性性分析。通过这些工作主要取得了以下成果:  1.基于黄花棘豆Illumina测序开发出的微卫星引物,从中随机挑选出86对引物。经过初步PCR筛选、克隆测序以及部分群体的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证后,从中选出14对多态性良好且扩增结果稳定的引物。利用14对SSR引物对我国黄花棘豆的33个居群、368个个体进行遗传多样性和遗传结构的分析。观察等位基因数Na=13.714,有效等位基因数Ne=5.232,Shannon指数1.797,观察杂合度Ho=0.464,预期杂合度He=0.762,多态信息含量PIC=0.731,基因流Nm=0.592。表明黄花棘豆在14对SSR引物中的遗传多样性处于较高水平。利用Structure计算得到所有居群的最佳分类值,最佳值K=2,即33个居群被划分为两大类群。第一类群包括:宁夏、甘肃、青海、西藏地区的黄花棘豆居群;四川地区的居群均被划分到第二类群。其中在甘肃碌曲县GS6和四川若尔盖地区SC6这两地区之间的地理距离较近,且两居群之间存在基因间渗的现象较为明显。居群的遗传变异分析表明,黄花棘豆在居群内部存在的遗传变异较高、占比73.62%,居群间的遗传多样性较低、占26.28%。群体间的分化系数Fst=0.297,表明群体间存在的遗传分化较大,且可能会导致遗传漂变。地理环境与遗传信息的相关性分析表明,黄花棘豆的遗传多样性与地理距离之间存在显著的正相关性(r=0.5226,p<0.001);遗传距离与地理海拔之间也存在显著的相关性(r=0.4242,p<0.001)。使用生态模拟DIYABC分析黄花棘豆的拓殖路线,我国北部地区的黄花棘豆最先分化,其次是地理位置处于中部地区的居群逐渐分化出南部四川地区的居群。由此可以推断出,我国的黄花棘豆起源于北部地区,并且逐步由北部地区向南部扩张。  2.使用高效液相法对33个居群的黄花棘豆进行苦马豆素的含量检测,发现在甘肃、青海、宁夏、西藏地区的大部分居群中,均含有苦马豆素;而四川大部分地区的居群内苦马豆素的含量为0。通过SPSS差异分析,两大类群间的苦马豆素含量存在显著的差异(p=0.007<0.05)。  3.采用绝对实时定量PCR技术和限制性内切酶,通过制作标准菌株Undifilum oxytropis表达量的标准曲线,对样品中所含内生菌Undifilum oxytropis进行绝对定量检测,随后经过琼脂糖凝胶电泳检测内生菌Undifilum oxytropis的特异性酶切验证。通过分析两大遗传划分类群之间的内生菌含量的差异分析表明:内生菌的含量在两大类群之间不存在显著性(p=0.058>0.050)。  4.黄花棘豆的遗传距离、地理距离、苦马豆素、内生菌的相关性分析表明,苦马豆素与内生菌存在显著的相关性(r=0.356,p=0.042<0.005)。遗传距离与苦马豆素(r=0.2184,p=0.001<0.005)、遗传距离与内生菌(r=0.1801,p=0.036<0.005)之间呈显著的正相关性;地理距离与苦马豆素(r=0.3400,p=0.001<0.005)、地理距离与内生菌之间(r=0.2215,p=0.033<0.005)同样存在显著的正相关性。  根据以上结果,可以为黄花棘豆的防控提供新的思路与方法。为了防治黄花棘豆在我国的大范围蔓延,我们可以从黄花棘豆的起源地入手,消除黄花棘豆在起源地的遗传多样,从而可以减弱黄花棘豆的扩张速度和危害程度。
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