组蛋白甲基化修饰和mRNA甲基化修饰是表观遗传中两种非常重要的组成成分,组蛋白甲基化修饰参与调控靶基因的转录,mRNA甲基化修饰参与调控靶mRNA的加工、成熟、翻译过程以及稳定性,两者共同调控细胞内蛋白质的表达水平。其中,组蛋白赖氨酸甲基化修饰和mRNA的m~6A修饰在现阶段研究较为深入。正常生理状态下,这两种甲基化修饰在各自的甲基转移酶(“writer”)、去甲基化酶(“eraser”)和效应蛋白(“reader”)严格、精密地调控下参与胚胎发育、细胞分化、DNA损伤修复、X染色体失活、神经元发育等众多重要的生命过程。当某一调控蛋白的表达和/或功能异常时,原有的稳态被破坏,异常的调控状态与包括多种恶性肿瘤在内的各种疾病的病程发展紧密相关。通常情况下,这些失控的调控因子在肿瘤细胞中异常过表达。其中,DOT1L(Disruptor of Telomeric Silencing 1-Like)是唯一不含SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶;YTHDF1(YTH Domain-Containing family protein 1)和YTHDF2是最早被发现和研究的mRNA的m~6A修饰“reader”蛋白。针对三者在细胞内发挥作用的机制以及药物发现研究是当下表观遗传修饰研究领域的重要研究内容。对于DOT1L,现有结构和功能研究多集中于DOT1L的N端催化结构域,剩下的约占蛋白全长三分之二的C端区域在DOT1L催化甲基转移的过程中发挥的功能以及在DOT1L致病机制中的作用未被完全揭示。虽然已有大量靶向DOT1L的小分子抑制剂报道,但活性和选择性较好的核苷类抑制剂具有相似的骨架结构,稳定性不好,药物代谢动力学性质不佳还易诱导产生耐药性;非核苷类抑制剂多被活性和选择性欠佳所困扰。此外,进入临床研究阶段的DOT1L抑制剂EPZ-5676最终未能成功上市。对于YTHDF1和YTHDF2,现有结构研究仅限于YTH结构域且晶体结构数据较少;功能研究也还处于刚刚展开的阶段,其在许多细胞生物功能和肿瘤等疾病中的作用机制亟待仔细阐明。不同于DOT1L,截至目前并无靶向YTHDF1或YTHDF2的小分子抑制剂报道。因此,发现靶向这三个靶标的全新选择性高效小分子抑制剂对促进其功能、机制研究与药物发现研究具有重要意义。本论文中,针对DOT1L,我们在已报道小分子抑制剂的结构中引入能提高化合物过膜能力的氨基侧链,并合成了系列骨架新颖的DOT1L小分子抑制剂。经过分子水平的酶活检测、结合确证,我们发现新合成的小分子抑制剂能有效地抑制DOT1L的酶催化活性。继而细胞水平的增殖抑制实验证明引入氨基侧链使改造后小分子抑制剂的细胞增殖抑制活性得到显著提升。同时,实时荧光定量PCR实验、Western Blot实验以及细胞周期检测的结果表明,这些小分子抑制剂能够在细胞内靶向DOT1L并通过将细胞阻滞在G0/G1期发挥增殖抑制活性。此外,结合模式与构效关系分析为后续的结构优化改造提供了有价值的参考。针对YTHDF1,我们首先通过荧光偏振方法(FP)高通量筛选了实验室自有化合物库发现了DC-Y20。接着,通过FP和AlphaScreen实验进行活性确证以及多种定性和定量实验进行结合确证,我们确认化合物DC-Y20能够结合YTHDF1并有效抑制其与m~6A修饰底物的结合。最后,结合底物竞争实验、氢氘交换质谱与位点突变,我们明确了DC-Y20是YTHDF1的非底物竞争型抑制剂,可能通过诱导蛋白发生较大构象变化来发挥抑制作用。针对YTHDF2,我们在应用FP方法高通量筛选实验室自有化合物库并经确证后得到了苗头化合物DC-Y12。接着,经过寻找、购买并检测衍生物的活性,我们获得了活性更好的化合物DC-Y13,也确认了这类化合物骨架结构真实可靠。最后,通过结构优化改造以及基于多种生化实验的活性评价,我们最终拿到了水溶性和活性均有提升的衍生物DC-Y13-27用于后续优化与研究。综上,在本论文的不同课题中,我们运用多种分子和细胞水平的生化实验手段和技术:1)评价了结构优化改造获得的DOT1L小分子抑制剂的生物活性,为非核苷类DOT1L小分子抑制剂的进一步优化提供了有用的帮助与参考。2)分别寻找与发现了YTHDF1和YTHDF2的首个小分子抑制剂苗头(先导)化合物,为探索YTHDF1和YTHDF2的细胞功能、机制及其与疾病的联系以及药物发现研究提供可靠的先导化合物。