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目的 探讨人羊膜在制备和保存过程中的微生物安全性及其控制,为建立羊膜库提供便捷、有效的微生物控制方法。研究新鲜人羊膜的变应原性及其致敏后发生Ⅰ型变态反应的可能性。研究人羊膜的组织相容性,并对新鲜羊膜和保存“灭活”羊膜的免疫原性作客观评价,也为临床上羊膜移植的免疫安全性提供实验依据。 本研究参照国际标准化组织、国家药监局等权威机构对生物材料/制品的相关规定,评价羊膜制品的生物安全性,为将羊膜制品作为新型生物材料的临床应用提供理论依据。 本研究分为 3 部分: 实验一:羊膜制备与保存中的微生物安全性研究 实验二:新鲜羊膜致Ⅰ型超敏反应的变应原性研究 实验三:羊膜的免疫反应和组织相容性研究 方法 实验一:20 只剖宫产胎盘的羊膜取材后,均按不同的无菌处理程序和保存方法分组(生理盐水浸泡、庆大霉素—两性霉素 B 溶液浸泡;DMEM、纯甘油、纯甘油与 DMEM 1:1 混合以及真空干燥保存。)保存检测时段为 24 小时、1 月、3 月、12 月,均作细菌、真菌、支原体检测。5 只顺产胎盘的羊膜,用庆大霉素—两性霉素 B 溶液浸泡后,重庆医科大学硕士研究生学位论文 - 4 -作细菌、真菌、支原体检测。实验二:建立豚鼠全身主动过敏实验模型。分新鲜羊膜组、新鲜蛋清组(阳性对照)和 PBS 液组(阴性对照),每组 10 只豚鼠。观察豚鼠在致敏期和激发后的反应,化学荧光法检测外周血组胺含量,血液流变分析系统检测 4 项血液流变学指标(全血高切变率粘度、全血低切变率粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数)。实验三:建立 BALB/C 小鼠皮下埋植实验模型。按不同的埋植物分为新鲜羊膜组(FAM)、双层新鲜羊膜组(DFAM)、甘油保存羊膜组(GPAM)、绒毛膜组(阳性对照)和单纯手术组(阴性对照);各组又随机分为 5 个亚组,每组 6 只小鼠,分别对应术后 1w、2w、4w、8w、12w 共 5 个时相。在各检测时相,大体观察各组小鼠的活动、创面等情况,用流式细胞仪检测各亚组的外周血 CD3+CD25+表达,免疫组化法半定量检测各亚组组织切片中 CD3+、CD4+、CD8+、MHCⅡ+的表达,HE 染色光镜下观察植片及其周围组织的变化并作炎性细胞计数。结果实验一:仅用无菌生理盐水浸泡组中,有 2 只胎盘的羊膜出现细菌污染(大肠埃希菌、表皮葡萄球菌);20 只剖宫产胎盘的羊膜在其余各组中均未查出细菌、真菌、支原体污染。有 1 只顺产胎盘的羊膜经抗生素液浸泡后,仍查出乳酸菌。实验二:致敏期间各组豚鼠的体重变化无明显差别(P>0.05);激发后羊膜组豚鼠与阴性组表现一致,无异常反应;羊膜组外周血组重庆医科大学硕士研究生学位论文 - 5 -胺含量及 4 项血液流变学指标均与阴性对照无明显差别(P>0.05),与阳性对照有显著性差异(P<0.01)。实验三:1、大体观察移植术后各组小鼠的饮食、活动正常,创面均Ⅰ期愈合,埋植物周围软组织均未见明显坏死征象。2、外周血 CD3+CD25+的表达:术后 2w 内,FAM 组、DFAM 组、GPAM 组和单纯手术组外周血 CD3+CD25+的表达较均术前明显增高(P<0.01),术后 4w 逐渐回落。在各个时相,3 个 AM 组之间两两比较均无显著差别(P>0.05)。绒毛膜组外周血 CD3+CD25+的表达一直明显高于其余各组(P<0.01),并在术后 2~4w 达高峰。3、免疫组化染色检测 CD3+、CD4+、CD8+、MHCⅡ+细胞表达:(1) 术后同一时相不同实验组组织免疫细胞分型情况:FAM 组、DFAM 组和 GPAM 组在各个时相的 CD3+、CD4+、CD8+及术后中、晚期 MHCⅡ+的表达,两两比较均无显著差异(P>0.05)。术后早期,FAM 组和 DFAM 组的 MHCⅡ+表达略高于 GPAM 组(P<0.05)。绒毛膜组与 3 个 AM 组相比,CD3+、CD4+、MHCⅡ+均显著增多(P<0.01)。(2) 术后同一实验组在不同时相组织免疫细胞分型情况:术后 2w 内,FAM 组、DFAM 组和 GPAM 组均有一定量的 CD3+、CD4+、CD8+、MHCⅡ+细胞浸润。此后,各型免疫细胞的表达持续明显减少,术后 4w 较 2w 前显著降低(P<0.01)。术后早期,绒毛膜组的 CD3+、CD4+、MHCⅡ+均明显增多(P<0.01),CD4+/CD8+比值重庆医科大学硕士研究生学位论文 - 6 -达高峰。4、HE 染色:术后早期,成纤维细胞即从基质层方向渐进式浸润羊膜,原羊膜基质层的胶原结构逐渐溶解;上皮附近的成纤维细胞迅速成熟并合成胶原纤维囊、包裹羊膜植片,内层成纤维细胞于术后晚期浸及基底膜。术后 1~12w,羊膜组的炎症反应均显著弱于绒毛膜组(P<0.01);术后早期,新鲜羊膜移植的炎症反应略强于保存羊膜移植(P<0.05),但均可自行平息。结论实验一: 以“健康”剖宫产产妇的胎盘为羊膜的来源,是控制微生物安全的第一关。含 1000 U/ml 庆大霉素、2.5 μg/ml 两性霉素 B 的医用无菌生理盐水作为制备羊膜时的抗生素浸泡液,便捷有效。严格无菌操作下的常用保存方法,可基本保证羊膜在 1 年保存期内免受污染。实验二:经正规无菌处理后的新鲜羊膜、保存羊膜及其他形式的羊膜制品,一般不具有变应原性,不会引起Ⅰ型超敏反应。实验三:富含活性物质的新鲜羊膜与“灭活”的保存羊膜在体内表现出几无差别的免疫特性,即免疫原性很低,可看作免疫赦免组织。羊膜有良好的组织?