新型雌激素受体共调节因子CGI-27的功能研究

来源 :中国人民解放军军事科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chinetman
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雌激素受体(estrogen receptor,ER)在乳腺癌的发生发展中具有至关重要的作用,并已被公认为内分泌治疗的靶标及预后的重要指标,但临床中出现的术后复发、抗雌激素治疗耐药和乳腺癌转移等让我们意识到癌症的复杂性。进一步发现新的共调节因子,分析和理解其调节作用以及各信号通路之间的交叉反应对揭示乳腺癌的发生、发展及转移机制,发现新的早期诊断指标,开发有效的治疗药物具有重大意义。ER有两种亚型ERα和ERα,两者结构和功能有相似之处,但又不尽相同。它们都具有两个重要的转录激活结构域AF1和AF2,共调节因子也主要与这两个区域相互作用。与AF2结合的共调节因子已发现很多,但与AF1结合的却很少。由于AF1是雌激素不依赖的转录激活结构域,与抗雌激素治疗耐药有关,而且与其他信号通路的交叉反应也主要发生在该区域。所以我们利用ERααAF1为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统,筛选乳腺cDNA文库,发现一个新的ERα的共调节因子——CGI-27。目前对CGI-27的功能所知甚少,生物信息学分析没有明显的特殊结构域。对CGI-27晶体结构的研究发现CGI-27与一类儿茶酚双加氧酶的结构相似。CGI-27可以通过接头蛋白SHC与1227位酪氨酸磷酸化的ERBB2癌蛋白相互作用,促进乳腺癌的迁移。由于没有商业化的抗体,我们构建和纯化了GST-CGI-27的融合蛋白,免疫Balb/c小鼠获得了抗CGI-27的多克隆抗体。利用该抗体我们发现CGI-27在大鼠的各组织、乳腺癌细胞系及其他癌细胞系中均有表达。通过免疫组化、激光共聚焦和核质分离实验发现CGI-27在乳腺癌组织和细胞中主要定位在细胞核和细胞膜。为了进一步确定CGI-27与ER的相互作用,我们通过GST pull-down实验和免疫共沉淀实验证明了CGI-27在体内和体外均能和ERα、ERα结合,利用内源免疫共沉淀还证明CGI-27和ERα在生理条件下也能结合。雌激素(E2)不能增强CGI-27与ERs的结合。ERα结合在CGI-27的N端1-146aa;CGI-27则和ERα的AF1和AF2都能结合。通过激光共聚焦实验发现CGI-27与ERα在细胞核中存在共定位现象。在293T、MCF-7、ZR75-1和SKBR3细胞中,过表达CGI-27能以激素不依赖的方式升高ERα和ERα的转录活性,而且这种升高具有剂量效应。通过转录活性实验我们还发现CGI-27升高ERα的转录活性依赖于ERα以及他们之间物理性的相互作用。从转录水平到蛋白水平检测CGI-27均不能改变ERα的表达。利用构建的CGI-27 siRNA敲低CGI-27的内源表达能降低ERα和ERα的转录活性。过表达CGI-27能升高下游基因c-Fos、c-Myc、CatD以及CyclinD1的表达,不影响PAI1、pS2和C3的表达。通过结晶紫实验和流式细胞检测技术发现CGI-27能促进细胞增殖,软琼脂实验和裸鼠成瘤实验发现CGI-27能促进肿瘤的非锚定依赖生长和肝转移。ERBB2能协同CGI-27升高ERα的转录活性,但对ERα没有协同作用。利用ERBB2或c-SRC的抑制剂抑制这两个蛋白功能后能减弱CGI-27对ERα转录活性的升高作用。进一步检测激酶的磷酸化水平发现,CGI-27能增强ERK1/2、AKT和ERααS118、S167位的磷酸化。突变ERα不同位点发现S104、S106、S118、S167、S305、S518及Y537对CGI-27升高ERα磷酸化和转录活性至关重要,而S236、T311位点影响不大。CGI-27在H192位的突变体不能升高ERα的转录活性。综上所述,CGI-27能与ERs相互作用,升高ERK1/2、AKT、ERα的磷酸化及其转录活性,促进细胞生长和转移。ERBB2能协同CGI-27升高ERα的转录活性,提示CGI-27不仅是ERα的共调节因子,而且在乳腺癌的发生发展、转移和耐药机制中发挥重要作用,有可能成为抗肿瘤药物开发的新靶标。
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