从中国传统药用植物青蒿(Artemisia annua L．)中提取的青蒿素（倍半萜内酯类化合物）是一种抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿中青蒿素的含量较低(0.01-0.8％)，导致青蒿素类抗疟药物的成本较高，而疟疾的流行区域又主要分布在发展中国家。为了降低青蒿素类抗疟药的价格，可以利用植物基因工程技术来提高转基因青蒿中青蒿素的含量，但青蒿素生物合成途径仍不完全清楚，因此本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了青蒿分泌腺毛cDNA文库的构建，青蒿素生物合成相关基因的克隆及功能分析工作，取得了以下结果：　　 一、青蒿分泌腺毛cDNA文库的构建及表达序列标签(ESTs)分析　　 青蒿的分泌腺毛(glandular secretory trichome)被认为是青蒿素合成及储存的位点，为了寻找参与青蒿素生物合成的基因，我们用青蒿分泌腺毛为材料构建了一个cDNA文库。从文库中随机挑取1985个单克隆从5’端测序，最后得到1940个平均读长超过500bp的高质量ESTs。然后对ESTs数据进行聚类和拼接去除冗余，得到1220个unigenes(1026个singlets、194 multimember EST clusters)。依据它们参与的生物学过程，这些unigenes被分成12类，其中45%是未分类的蛋白(22%是功能未知的蛋白、23%是没有比对信息的蛋白)；在比对上的已知功能的基因中，代谢占14.2%，蛋白合成、修饰、折叠占11.4%，细胞结构占5.5%,光合占5.0%，转运占4.8%，翻译和翻译调节占4.0%，防卫占3.3%，信号转导占3.3%，能量占2.0%，其它占2.1%。cDNA文库中参与青蒿素生物合成的基因包括法呢基焦磷酸合酶(1个EST)，紫穗槐二烯合酶(2个ESTs)，细胞色素P450还原酶(1个EST)。文库中还发现一个倍半萜柏木脑合酶基因（2个ESTs)和一个单萜芳樟醇合酶基因(1个EST)。推断可能与青蒿素合成相关的候选基因包括：肉桂醇脱氢酶基因（2个ESTs），IPP/DMAPP合酶基因（2个ESTs），推断的环化酶基因(1个EST)以及WRKY转录因子基因（2个ESTs）。　　 二、青蒿AaWRKY1转录因子基因的克隆与功能研究　　 青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS)是一倍半萜环化酶，它催化FPP环化生成紫穗槐二烯，是青蒿素生物合成的关键酶之一。ADS基因的启动子含有W-box顺式元件，这是WRKY转录因子的结合位点。我们从分泌腺毛（青蒿素合成和积累的主要部位）的cDNA文库中分离到一个WRKY转录因子，命名为AaWRKY1。AaWRKY1编码311个氨基酸，包含一个保守的WRKY结构域和一个(C-X7-CX23-H-X1-C)型锌指结构域，属于类型Ⅲ WRKY蛋白。AaWRKY1和ADS在分泌腺毛中都有高丰度的表达，它们都受茉莉酸甲酯和真菌诱导子壳聚糖的诱导。以GFP为报告基因的瞬时表达分析表明，AaWRKY1定位于细胞核。凝胶滞后实验和酵母单杂交的结果表明，AaWRKY1能结合来源于ADS启动子上的W-box顺式元件。AaWRKY1在转基因烟草中稳定过表达和在农杆菌注射烟草叶片中瞬时过表达实验结果表明，AaWRKY1能够激活ADS启动子，上述结果表明ADS是AaWRKY1转录因子的目标基因。　　 三、中药青蒿异戊烯焦磷酸异构酶基因的克隆与功能分析　　 采用RACE技术从青蒿中克隆了异戊烯焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase)基因(命名为AaIPI)，该基因全长为1148bp，其中编码区为852bp，编码一个由284个氨基酸组成的蛋白质。AaIPI氨基酸序列与拟南芥、烟草、玉米、水稻和伯惠绣衣的IPI有66.20%-72.41%的同源性。将N端缺失掉转运肽的异戊烯焦磷酸异构酶cDNA插入到原核表达载体pET30a(+)，构建成N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET(-tp)AaIPI。AaIPI经大肠杆菌异源表达和镍琼脂糖柱纯化后，分别以IPP和DMAPP为底物进行体外酶促反应，GC-MS分析酶促反应体系的乙醚萃取物，结果显示AaIPI可以催化IPP向DMAPP转化，也能够催化DMAPP向IPP转化，在反应体系中加入DMAPP或IPP底物，最终的反应体系中DMAPP的量是IPP量的7.0-7.3倍，说明此异构酶更倾向于将IPP转化为DMAPP。Southern blot分析表明，AaIPI基因在青蒿基因组中至少有三个拷贝。