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草酸氧化酶(EC1.2.3.4,Oxialate oxidase,OxO)催化草酸氧化产生CO2和H2O2。生物信息学分析表明水稻中编码OxO的基因有四个,在三号染色体上以串联的形式排列,其编码框的同源性在90-98%之间。其中OsOxO2、OsOxO3和OsOxO4主要在种子萌发过程中表达,OsOxO1主要在内外稃中表达。前期的结果显示:水稻中的OxO很可能通过降解草酸参与了胚芽鞘和内外稃的衰老。本研究采用RNA干涉和过量表达技术来调控水稻中的OxO活性,旨在从分子水平探讨Oxo在胚芽鞘和内外稃衰老及维管束转换区中的作用。获得的主要结果如下:
1.过量表达OsOxO1和干涉OsOxO表达载体的构建及遗传转化
以水稻内外稃cDNA为模板,利用RT-PCR扩增到含有OsOxO1完整ORF和干涉OsOxO表达的片段,构建了过量表达OsOxO1的载体pOX—OsOxO1和干涉OsOxD表达的组成型载体pYL—OsOxOin。通过农杆菌介导法将其转入水稻愈伤组织,成功获得了过量表达OsOxO1和干涉OsOxO的转基因植株。
2.转基因植株的筛选与鉴定
大部分过量表达植株中的OxO活性显著提高,其中不可溶的活性最高达3.456μmolH2O2/gFW.min,可溶的最高达0.5374μmolH2O2/gFW.min。大部分干涉植株中的OxO活性降低。过量表达植株中OsOxO1的表达明显增加;干涉植株胚芽鞘和维管束转换区中OsOxO1的表达明显下降,而OsOxO2和OsOxO3的表达在各株系间不一致,OsOxO4的表达则未被下调。
3.OsOxO功能分析
OsOxO1编码的蛋白具有OxO活性,其分子量约为134KDa,推测其为同源六聚体。过量表达植株中H2O2和草酸含量与野生型无明显差异,其CAT和POD活性皆与野生型无差异,SOD活性则高于于野生型。此外,过量表达OsOxO1的水稻幼苗对盐胁迫、冷处理和镉胁迫处理耐性皆有提高。调控OsOxO表达对水稻发芽势和发芽率未产生显著的影响,但下调OsOxO表达后,其结实率明显降低。