T细胞淋巴瘤(T-cell lymphomas,TCLs)和慢性淋巴细胞白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)分别为来源于T细胞及B细胞的恶性血液系统肿瘤。CLL是B淋巴细胞来源的恶性疾病,异质性高,B淋巴细胞聚集在外周血、骨髓和淋巴组织,是西方国家最常见的成人白血病类型。虽然许多新型药物的出现使CLL病人的预后得到改善,但是耐药性的产生仍然是CLL治疗中难以突破的瓶颈。以氟达拉滨为基础的化疗方案仍然是CLL的一线治疗方案。但是,复发和难治性CLL对于氟达拉滨的反应性降低,中位生存期少于一年,预后不良。因此,寻求新的逆转氟达拉滨的治疗方法十分必要。氟达拉滨是一种嘌呤类似物,能下调脱氧核苷酸储备,从而引发双链DNA断裂,导致DNA复制受阻,发生复制应激。若DNA发生复制应激应答,DNA复制叉停滞,引起细胞对氟达拉滨耐药。TCL是一组高度异质性的淋巴系统恶性肿瘤。T细胞淋巴瘤比B细胞淋巴瘤侵袭性更强且病人预后更差,但其病因及发病机制尚有待研究证实。越来越多的研究表明细胞信号通路异常在T细胞淋巴瘤发病机制中有重要的作用,例如PI3K/AKT通路。因此,探究并揭示这些信号通路中异常作用的分子及其与肿瘤发生发展的关系,是T细胞淋巴瘤研究中重要的课题。细胞周期是细胞分裂所经过的一系列过程,包括DNA复制和两个子细胞的产生。细胞周期分为间期和分裂期两相,以细胞核中DNA的复制和分裂作为主要标界将细胞周期确定为四个期:DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和分裂期(M期)。G1期决定了细胞周期的长短,不同的细胞的细胞周期长短并不一致,短至几个小时,也可长至几十年。在肿瘤细胞中,有的细胞具有很短的细胞周期,分裂增殖很快,如T细胞淋巴瘤,也有的细胞呈惰性状态,主要位于G1期,分裂增殖的细胞较少,例如慢性淋巴细胞白血病。细胞周期蛋白在恶性肿瘤的发生发展中有重要作用。通过数据库分析,我们发现细胞周期蛋白中心粒蛋白55(Centrosomal protein 55,CEP55)和微小染色体维持蛋白(Minichromosome maintenance,MCM)分别在T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病中有较高表达,因而推测并验证了 CEP55和MCM在肿瘤发生发展中的作用。十几年前,人们发现并定义了 CEP55,它是一种与中心粒和中心体相关的蛋白,在细胞周期中参与两个子细胞的物理分离及细胞分裂过程的完成,在细胞分裂中具有重要作用。利用mRNA微阵列技术,人们在许多肿瘤疾病中发现了 CEP55的高表达,这种高表达导致了不稳定多核细胞的聚集,这是产生肿瘤的重要诱因。CEP55的过表达能促进细胞迁移和浸润,而抑制CEP55能显著提高细胞凋亡率。微小染色体维持蛋白是细胞周期中S期检查点相关蛋白,在DNA复制和细胞周期进程中具有重要作用。在G1期,MCM2-7形成复制前蛋白,结合到染色体上启动DNA复制,其亚单位MCM4-6-7具有水解酶活性,能在使染色体在复制叉处解旋。DNA发生损伤时,MCM7在S期与ATM/ATR通路中的因子相互作用,发挥细胞周期检查点的功能,而ATM/ATR通路在CLL发生发展中有重要作用。并且有研究报道,在骨髓异常增生综合征和套细胞淋巴瘤中MCM家族蛋白比Ki-67具有更好的预后预测价值,且在急性髓系白血病中MCM7与复发和总生存期相关。第一部分CEP55在T细胞淋巴瘤发生发展中的作用研究研究目的:本研究旨在阐明CEP55在T细胞淋巴瘤发生发展中的作用及其机制;分析CEP55表达量与T细胞淋巴瘤的临床病理联系;并在体外敲减T细胞淋巴瘤细胞株的CEP55表达后对细胞株的生物学行为进行检测,力求探明CEP55在T细胞淋巴瘤中的表达及其作用。材料与方法:1.病例标本选择及收集;2.细胞培养;3.免疫组织化学;4.提取总蛋白及免疫印迹实验;5.利用CEP55 siRNA敲减T细胞淋巴瘤细胞株;6.CCK-8实验检测细胞活性;7.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;8.统计学分析。研究结果:1.利用免疫组织化学技术检测46例T细胞淋巴瘤患者及15例反应性增生淋巴结(reactive hyperplasia of lymphnodes,RHLs)。以标本中有大于30%的可染细胞为阳性判定指标,CEP55在外周T细胞淋巴瘤,非特指型(peripheral T-cell lymphoma-not otherwise specified,PTCL-NOS)、血管免疫母细胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-cell lymphoma,ATCL)、T 淋巴母细胞淋巴瘤(T-cell lymphoblastic lymphoma,TLBL)、肠病相关 T 细胞淋巴瘤(Enteropathy-associated T-cell lymphoma,EATL)、NK/T 细胞淋巴瘤(natural killer/T-cell lymphoma,NK/TCL)中阳性率分别为 72.73%、55.56%、85.71%、66.67%、77.78%,显著高于反应性增生淋巴结中的阳性率。2.经Pearson卡方检验或必要时经Fisher确切概率检测,CEP55与Ki-67的表达显著相关(P=0.0171)3.抑制T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat、Karpass299、Myla3676中的CEP55表达,利用CCK-8检测细胞活性,发现敲减CEP55后细胞活性显著降低,细胞凋亡率显著增加。研究结论:上述研究表明,CEP55在T细胞淋巴瘤标本及细胞株中表达增高,且CEP55在T细胞淋巴瘤中的表达与Ki-67的表达呈显著相关。敲减CEP55可减弱T细胞淋巴瘤细胞株的生物活性,并增加凋亡率。以上结果有助于阐明CEP55在T细胞淋巴瘤发生发展中的作用。第二部分MCM7介导慢性淋巴细胞白血病发生氟达拉滨耐药的机制研究研究目的:本研究旨在阐明MCM7在CLL细胞发生对氟达拉滨耐药中的作用及其机制;并对体外敲减MCM7对CLL耐药性的影响进行评估,为寻求逆转CLL对氟达拉滨耐药的治疗方法提供理论依据。材料与方法:1.病例标本选择及收集;2.分离外周血单个核细胞(PBMCs);3.流式细胞术检测CD19+ B细胞及γ-H2A.X含量;4.细胞培养;5.Anti-BCR及anti-CD40联合刺激CLL原代细胞;6.提取RNA及实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR);7.提取总蛋白及免疫印迹实验;8.分别用MCM7 siRNA和慢病毒敲减CLL原代细胞及细胞株;9.CCK-8实验检测细胞活性;10.EDU实验检测细胞增殖情况;11.Annexin V-PE/7AAD法检测细胞凋亡;12.PI法检测细胞周期;13.统计学分析。研究结果:1.MCM7在CLL原代细胞及细胞株中表达增高。通过流式细胞术检测,PBMCs中含90%以上CD19+B细胞的CLL标本纳入为原代细胞。通过RT-PCR检测28例CLL病人标本、CLL细胞株MEC-1和EHEB、以及8例正常人PBMCs中MCM7的mRNA含量,我们发现CLL原代细胞及细胞株中的MCM7含量的高于正常人(P<0.01)。2.在CLL原代细胞中MCM7减弱细胞对氟达拉滨引发DNA损伤的应答。我们利用siRNA敲减CD40刺激后的CLL原代细胞中的MCM7,westernblot验证其蛋白表达量减少。用annexin V-PE/7-AAD和流式细胞术检测11例敲减后的CLL原代细胞的凋亡率,与阴性对照细胞相比,凋亡率并未明显增加;而用氟达拉滨作用于MCM7敲减后的CLL原代细胞24小时,检测凋亡率,与阴性对照细胞相比,经MCM7敲减的细胞凋亡增加(P<0.01)。(且去除氟达拉滨或DMSO作用后,γ-H2A.X表达量下降延迟(P<0.05)。3..在MEC-1及EHEB细胞株中敲减MCM7减弱细胞生物学活性。对MEC-1和EHEB两个细胞株进行阴性对照慢病毒(shNC)和MCM7慢病毒转染(shMCM7)转染,并筛选稳定转染细胞株,以RT-PR和western blot验证转染效率。在MEC-1和EHEB中,转染了 shMCM7的CLL细胞株与转染shNC的细胞株相比,CCK-8实验显示细胞活性下降(P<0.05)。细胞周期阻滞在S期(P<0.01)、细胞凋亡增加(P<0.05)。4.抑制MCM7提高了 CLL细胞株对氟达拉滨的敏感性。与阴性对照细胞株(DMSO作用于细胞)相比,敲减MCM7使氟达拉滨作用于CLL细胞株24小时后,细胞活性下降更多(P<0.01),shMCM7转染的细胞比shNC转染细胞的产生更高的凋亡比例(P<0.01)。5.CLL细胞株敲减MCM7导致氟达拉滨引发的复制应激增强。EDU实验表明经MCM7敲减的细胞株EDU阳性细胞比例增加,细胞增殖比例较对照组增加(P<0.01);进一步经western blot验证,随着氟达拉滨的浓度升高,敲减后的CLL细胞株γ-H2A.X表达比阴性对照组增高。研究结论:上述研究表明,MCM7在CLL原代细胞及细胞株中表达增高。敲减MCM7可减弱CLL细胞株的生物活性,并提高CLL原代细胞及细胞株对氟达拉滨的反应性,有望作为逆转氟达拉滨耐药的新的治疗策略。