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揭示水稻抗病与生长的协调机制,培育具有广谱抗病性的水稻品种对于水稻的稳产和增产具有重要现实意义。本研究主要利用蛋白质组学与基因编辑等技术,从表型、生理生化、亚细胞结构、代谢途径、蛋白互作等不同层面,对OsCUL3a协调抗病与生长,特别是与重要免疫相关基因OsNPR1/2/3在控制细胞死亡方面的关系进行研究。本文主要研究结果如下:
1.利用体视显微镜观察发现oscul3a突变体类病斑的形成可能由叶片局部组织区域的H2O2积累和细胞死亡产生,然后逐渐扩展到整片叶片;不同时期水稻叶片DAB染色发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体叶片在50DPS开始H2O2积累,在60DPS时H2O2积累表型非常明显。这种动态的生理变化,使oscul3a突变体对稻瘟病和白叶枯病具有广谱抗病性,使其在生长后期的抗病性会显著提高。
2.相比野生型ZH11和转基因互补材料p1300-OsCUL3a-1和p1300-OsCUL3a-2,oscul3a突变体的生长速率在35DPS-55DPS阶段相对较慢,与oscul3a突变体H2O2的动态积累和细胞死亡表型出现阶段的细胞生理条件变化有关,最后导致oscul3a突变体的株高显著降低,这主要反应在显著变短的穗长和水稻茎秆倒数第一节间长度。
3.透射电镜观察发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体在70DPS生长期的叶片细胞胞质中有大量脂质体积累,在叶绿体中有大量嗜锇颗粒积累,脂质体和嗜锇颗粒的积累与脂类代谢有关;oscul3a突变体的稻米千粒重降低,其稻米的粗脂肪含量显著升高,总淀粉和总蛋白含量略有降低;随后稻米扫描电镜观察发现oscul3a突变体的淀粉颗粒结构变小,大小不一。
4.利用串联质谱标记(Tandem Mass Tag,TMT)的蛋白质组检测技术,在oscul3a突变体叶片类病斑表型出现前和出现后分别检测到4623和4572个蛋白信息。相比野生型ZH11,在oscul3a突变体叶片中分别含有263和947个差异表达蛋白,其主要定位在叶绿体和胞质中,主要参与细胞内代谢过程,使oscul3a突变体的脂类次生代谢途径增强,而碳氮代谢途径减弱;并发现苯丙烷类(phenylpropanoid)代谢途径中具有抗病功能的水杨酸(salicylic acid,SA)含量在oscul3a突变体叶片中显著升高;并首次鉴定发现该代谢途径另一种次生代谢产物香豆素具有稻瘟病菌生长抑制活性,可诱导水稻愈伤ROS产生。STRING分析发现OsCUL3a与鉴定到的分子开关蛋白间会形成一个具有核心互作区的复杂调控网络,并通过平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)靶向蛋白检测技术,验证了其中在水稻叶片类病斑表型出现前后高表达的蛋白CM-LOX1和CM-LOX2,其属于脂氧合酶类蛋白,是参与脂质过氧化造成铁诱导的细胞死亡(ferroptosis)的重要酶类。
5.利用CRISPR-Cas9技术,获得在野生型ZH11背景下定向敲除了OsCUL3a的转基因植株,其具有类病斑表型;随后的酵母双杂交实验证明OsNPR2、OsNPR3与OsNPR1间存在相互作用;而在oscul3a突变背景下分别敲除OsNPR2和OsNPR3,敲除成功的oscul3a/osnpr2双突叶片类病斑较少,但敲除成功的oscul3a/osnpr3双突叶片具有非常严重的细胞死亡和类病斑表型;结合前期已有的OsNPR1敲除可以消除oscul3a突变体叶片类病斑表型,从而发现OsNPR1/2和OsNPR3在oscul3a突变背景下具有相反的细胞死亡与类病斑表型控制机制。
1.利用体视显微镜观察发现oscul3a突变体类病斑的形成可能由叶片局部组织区域的H2O2积累和细胞死亡产生,然后逐渐扩展到整片叶片;不同时期水稻叶片DAB染色发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体叶片在50DPS开始H2O2积累,在60DPS时H2O2积累表型非常明显。这种动态的生理变化,使oscul3a突变体对稻瘟病和白叶枯病具有广谱抗病性,使其在生长后期的抗病性会显著提高。
2.相比野生型ZH11和转基因互补材料p1300-OsCUL3a-1和p1300-OsCUL3a-2,oscul3a突变体的生长速率在35DPS-55DPS阶段相对较慢,与oscul3a突变体H2O2的动态积累和细胞死亡表型出现阶段的细胞生理条件变化有关,最后导致oscul3a突变体的株高显著降低,这主要反应在显著变短的穗长和水稻茎秆倒数第一节间长度。
3.透射电镜观察发现,相比野生型ZH11,oscul3a突变体在70DPS生长期的叶片细胞胞质中有大量脂质体积累,在叶绿体中有大量嗜锇颗粒积累,脂质体和嗜锇颗粒的积累与脂类代谢有关;oscul3a突变体的稻米千粒重降低,其稻米的粗脂肪含量显著升高,总淀粉和总蛋白含量略有降低;随后稻米扫描电镜观察发现oscul3a突变体的淀粉颗粒结构变小,大小不一。
4.利用串联质谱标记(Tandem Mass Tag,TMT)的蛋白质组检测技术,在oscul3a突变体叶片类病斑表型出现前和出现后分别检测到4623和4572个蛋白信息。相比野生型ZH11,在oscul3a突变体叶片中分别含有263和947个差异表达蛋白,其主要定位在叶绿体和胞质中,主要参与细胞内代谢过程,使oscul3a突变体的脂类次生代谢途径增强,而碳氮代谢途径减弱;并发现苯丙烷类(phenylpropanoid)代谢途径中具有抗病功能的水杨酸(salicylic acid,SA)含量在oscul3a突变体叶片中显著升高;并首次鉴定发现该代谢途径另一种次生代谢产物香豆素具有稻瘟病菌生长抑制活性,可诱导水稻愈伤ROS产生。STRING分析发现OsCUL3a与鉴定到的分子开关蛋白间会形成一个具有核心互作区的复杂调控网络,并通过平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring,PRM)靶向蛋白检测技术,验证了其中在水稻叶片类病斑表型出现前后高表达的蛋白CM-LOX1和CM-LOX2,其属于脂氧合酶类蛋白,是参与脂质过氧化造成铁诱导的细胞死亡(ferroptosis)的重要酶类。
5.利用CRISPR-Cas9技术,获得在野生型ZH11背景下定向敲除了OsCUL3a的转基因植株,其具有类病斑表型;随后的酵母双杂交实验证明OsNPR2、OsNPR3与OsNPR1间存在相互作用;而在oscul3a突变背景下分别敲除OsNPR2和OsNPR3,敲除成功的oscul3a/osnpr2双突叶片类病斑较少,但敲除成功的oscul3a/osnpr3双突叶片具有非常严重的细胞死亡和类病斑表型;结合前期已有的OsNPR1敲除可以消除oscul3a突变体叶片类病斑表型,从而发现OsNPR1/2和OsNPR3在oscul3a突变背景下具有相反的细胞死亡与类病斑表型控制机制。