陆地棉MFT-like亚家族基因的克隆与功能研究

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在植物中,磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatiylethanolamine-binding proteins,PEBP)家族被划分为以下三类,即为FLOWERING LOCUS T(FT)-like、TERMINAL FLOWER1(TFL1)-like和MOTHER OF FT AND TFL1(MFT)-like。FT-like调节分生组织有限的生长和TFL1-like调节分生组织无限的生长,并最终影响开花时间和植株的构型。MFT通常被认为是FT/TFL1的祖先,但其功能尚不清楚。最近研究揭示了MFT同源基因可能在调控植物开花和种子萌发等方面具有十分重要的作用,MFT基因缺失突变体(mft-2)的开花表型不受影响,但对ABA敏感,其萌发率较低;而四倍体陆地棉中MFT-like基因的功能还不是很清楚。目的:通过对GhMFT-like基因的生物信息学和表达模式的分析以及转基因拟南芥和棉花的研究,初步确定GhMFT-like基因在调控棉花胚珠发育和种子萌发中的作用。方法:采用RT-PCR技术进行GhMFT-like基因的克隆;构建GhMFT-like-GFP融合载体、BD-GhMFT-like和nYFP-GhMFT-like,观察GhMFT-like-GFP蛋白的亚细胞定位及与GhFD蛋白相互作用;采用实时荧光定量PCR仪(qRT-PCR)分析GhMFT-like基因的表达情况;构建GhMFT-like植物表达载体,采用浸花法(floral-dip)转化拟南芥;构建GhMFT-like的过表达载体、干扰载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体进行棉花的遗传转化。结果:(1)全基因组分析揭示了陆地棉基因组中共包含2个MFT-like同源基因,即GhMFT1和GhMFT2。(2)本研究克隆了2个棉花MFT-like同源基因,GhMFT1的ORF长度为519 bp,GhMFT2的ORF长度为528 bp。(3)GhMFT1基因在叶片、胚珠和纤维中表达量比较高,GhMFT2基因在茎、花和纤维中表达量比较高;在胚珠和纤维发育时期,GhMFT1和GhMFT2的表达量都比较高;在种子萌发过程中,GhMFT1和GhMFT2的表达量均下降,而且在外源提供ABA和NaCl时,它们都显著上调。(4)GhMFT-like定位于细胞质和细胞核中,并与GhFD蛋白相互作用。(5)在拟南芥中异位表达GhMFT1和GhMFT2不影响转基因拟南芥的开花;但是抑制转基因拟南芥种子的萌发,并且在ABA和NaCl处理时,转基因拟南芥种子的萌发率更低;GhMFT1和GhMFT2过表达不影响转基因拟南芥幼苗的生长;AtABI3、AtABI5、AtRGA和AtRGL2在转基因拟南芥种子中显著上调。(6)通过农杆菌介导的棉花的遗传转化,成功获得6株35S:GhMFT1过表达、9株35S:GhMFT2过表达和8株35S:GhMFT2-RNAi的T0代转基因植株;并成功获得13株GhMFT1-sgRNA1位点被编辑的T0代转基因植株、5株GhMFT1-sgRNA2位点被编辑的T0代转基因植株、18株GhMFT2-sgRNA3位点被编辑的T0代转基因植株和2株GhMFT2-sgRNA4位点被编辑的的T0代转基因植株。结论:陆地棉基因组中包含2个MFT-like的同源基因;2个GhMFT-like基因主要在纤维和胚珠中表达,并调控棉花胚珠的发育和种子的萌发;GhMFT-like与GhFD在细胞核中相互作用;异源表达GhMFT-like不促进转基因拟南芥的开花,但抑制转基因拟南芥的种子萌发;获得了GhMFT-like过表达、干扰和CRISPR/Cas9基因编辑的植株,有关转基因棉花的表型还有待进一步验证。
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