两种黏细菌代谢产物对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响

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目的微生物的代谢产物是近现代药物开发的重要来源,目前世界上正在使用的前100种药物中,有将近50%的药物是来自于微生物,尤其是抗癌药物,抗感染,心血管疾病和免疫抑制剂等,抗肿瘤化疗药物,除重金属和抗代谢药物外,就是最重要的抗生素,这些药物大多是在对微生物代谢产物的研究过程中偶然发现并加以利用和进一步加工而成的,在药源菌中,开发较多的是放线菌,真菌,链霉菌和芽孢杆菌等,也正是因为开发的程度较高,所以即使消耗大量时间花费大量金钱,也很难从这些微生物中分离出新的有效药物。自上个世纪五十年代科学家们观察到黏细菌分泌产物具有抗生素生物活性后,其具有的菌种特异性(同一个类别的不同菌种代谢产物不同,不同类别的菌种能产生众多结构类似的代谢产物)的特点,使得黏细菌得到了越来越多科研工作者的青睐,2008年被美国FDA批准上市的埃博霉素(epothilones)是最著名的从黏细菌代谢产物里提取的抗肿瘤活性物质,现已成为一线抗癌药物,其主要作用机制为加速细胞内微管聚集,与特效抗癌药紫杉醇相似,具有对产生MDR的细胞有很好的抑制作用,因其具有较小的副作用,无复杂的化学结构、较好的水溶性和来源于微生物发酵的途径,被认为是紫杉醇的更新换代产品,更好的抗癌药物,其中最重要的价值是黏细菌能产生各种丰富的次级代谢产物,具有多种新结构,作用机制的创新和多样化的特点,是公认的除放线菌外的新类群微生物药物的重要来源,秦巴山区作为我国最大的动植物自然资源保护区之一,其微生物蕴藏量在全国甚至全球都是绝无仅有的,其中蕴含的黏细菌类型更是多种多样,因此从中筛选代谢产物寻找抗肿瘤药物,具有独特的优势和巨大的潜力,黏细菌普遍存在于泥土及腐烂的树木植被中,能发酵出极其丰富的次级代谢物质,目前已从黏细菌代谢产物中发掘出数百种生物活性成分,绝大多数还未在其它组的微生物中发掘到,其中有代谢物比例较高的抗肿瘤物质,因此,筛选黏细菌次级代谢产物提取治疗恶性肿瘤的药物,具有得天独厚的优势及无限的潜力。本实验研究探讨两种从秦巴山区获得的黏细菌的次级代谢产物(NX52和NX83)作用HT-29细胞后对增殖情况其产生的结果,讨论次级代谢产物大致的机理。方法培养能稳定、健康传代的HT-29结肠癌细胞系,用倒置光学显微镜观察细胞形态特征,采用MTT法制出HT-29细胞的生长曲线,同事测算出群体倍增时间,应用MTT比色法检测不同浓度(0.1mg/ml、1.0mg/ml、10mg/ml)的两种黏细菌代谢产物(NX52、NX83)对体外培养的人结肠癌HT-29细胞增殖影响,并结合倒置显微镜观看代谢产物作用后的HT-29细胞的形态学特征。结果成功培养出了能稳定、健康传代的HT-29结肠癌细胞系,单个细胞未贴壁时呈椭圆形,细胞贴壁后平铺排列生长,呈长条状多边形,细胞生长速度较快,细胞间有聚集性,当细胞铺满瓶底80%以上时,细胞聚集粘合成团,细胞间聚合密实,边界清楚,细胞质清亮、饱满,透光性好,细胞倍增时间为40小时左右,黏细菌代谢产物各加药组较对照组增殖降低,且存在剂量-效果依赖性(0.1mg/ml、1mg/ml和10mg/ml)和时间-效果依赖性(24h、48h和72h),经过次级代谢产物处理过的HT-29细胞形态及增殖情况均发生改变,变化程度随着作用时间及代谢产物浓度增加而增大,倒置显微镜下可见加药孔细胞数目较对照孔明显减小,细胞间间隔明显变大,细胞膜皱缩、边缘模糊不清,大部分细细胞质内出现空泡,细胞形状不规则,形态各异,可见部分细胞碎裂。结论培养出的能稳定传代的HT-29细胞系可作为良好的体外肿瘤研究实验模型,NX52、NX83均为从秦巴山区中分离培育出的黏细菌的次级代谢产物,都对结肠癌HT-29细胞有抑制作用,代谢产物为初级提取物,由多种物质组成,从黏细菌的代谢产物特点及埃博霉素抗肿瘤的机制考虑,有理由认为本实验的两种代谢产物中可能含有抗肿瘤活性物质,作用机制可能同埃博霉素相似,如促进构成及稳定微管从而发挥阻止细胞的有丝分裂,或者抑制电子传递、破坏细胞骨架、抑制核酸聚合酶活性等影响细胞代谢、破坏细胞结构、抑制DNA复制等达到抗肿瘤作用,综上所述,本实验两种黏细菌次级代谢产物中均可能存在对结肠癌HT-29细胞有抑制作用的生物活性物质,为今后进一步研究确定黏细菌次级代谢产物中有抗肿瘤作用的物质及分离提纯出单体物质进行抑菌或抗肿瘤药物的开发提供实验依据。
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