一．研究背景 尽早封闭创面并最大可能地恢复功能与外观是烧伤治疗的主要目标，目前临床上治疗烧伤广泛采用的断层自体皮片移植法面临着自体皮源不足、增加创面面积、移植的皮肤挛缩及无皮肤附件等难题。皮肤组织工程技术为烧伤创面的修复提供了新的方法，以培养的角质形成细胞膜片或自体刃厚皮片为表皮层，以人工合成的真皮接种成纤维细胞或异体／异种脱细胞真皮为真皮层，已开发出多种组织工程皮肤，部分已商品化并取得了较好的临床效果。但现有各类组织工程皮肤也面临着一个共同的难题，即缺乏皮肤附件，如毛囊、皮脂腺和汗腺等。表皮干细胞是皮肤的成体干细胞，具有无限增殖潜能及多向分化潜能，理论上可以分化为皮肤的各种细胞成份和结构，如毛囊、汗腺等。毛乳头细胞为表皮干细胞壁龛提供了最好的条件，是诱导表皮干细胞向毛囊定向分化必需的条件。 组织工程皮肤面临的另一个重要难题是免疫排斥。异体脱细胞真皮是目前临床应用最为广泛的真皮替代物，虽然去除了真皮中的细胞成份，又通过戊二醛交联降低了胶原的免疫原性，但由于脱细胞真皮再血管化时间长，容易发生胶原变性而暴露其抗原决定簇，增加免疫排斥反应。人工真皮多接种异体成人的成纤维细胞，亦增加了其抗原性。而胎儿皮肤组织免疫原性相对较低，利用胎儿真皮修复烧伤创面未见明显免疫排斥反应，一些组织工程皮肤的真皮内亦接种胎儿成纤维细胞以降低可能的免疫反应。 第四军医大学博士学位论文 皮肤是一种较理想的基因治疗靶器官，但由于表皮的不断更新，外源基因难以持久表达。表皮干细胞是终身存在的，且千细胞的遗传信息可以传给子代细胞，因而是基因治疗理想的靶细胞。 二.研究目的 本课题的研究目的是利用毛乳头细胞诱导表皮干细胞分化为毛囊，利用胎儿皮肤细胞为种子细胞构建组织工程皮肤以最大限度地降低免疫原性，同时尝试将外源基因转染至表皮干细胞，为表皮干细胞应用于基因治疗提供初步的实验依据。 三.研究内容 1.体外分离培养人胎儿角质形成细胞。DISpase酶分离表皮和真皮;胰酶消化法获得表皮细胞悬液;冻存表皮细胞悬液以保证以后所有实验使用的角质形成细胞和表皮干细胞均为同一个体来源;用含有血清的DMEM培养基培养原代角质形成细胞并收集培养液用于下一步实验;用无血清培养基行传代培养;冻存角质形成细胞;同法培养成人皮肤角质形成细胞作为对照。 2.体外分离培养人胎儿成纤维细胞。DISpase酶分离表皮和真皮;胰酶消化法和组织块法培养成纤维细胞;收集成纤维细胞培养液用于下一步实验:冻存成纤维细胞;同法培养成人成纤维细胞作为对照。 3.人胎儿表皮干细胞的分离培养及鉴定。用Dispase酶分离表皮得到表皮细胞悬液或使用冻存的同一个体的表皮细胞悬液;采用W型胶原快速粘附法分离富集表皮干细胞;成纤维细胞条件培养液配制干细胞培养液进行培养;流式细胞仪分析细胞周期，测定克隆形成率，角蛋白19和整合素pl免疫组织化学染色进行鉴定并与角质形成细胞比较。 4.表皮干细胞的体外基因转染。扩增pcDNA3.1一VEGF165质粒;DNA限制性内切酶酶切分析及DNA测序鉴定扩增的质粒DNA;lipofecTAMINE脂质体介导VEGF165基因转染;重组腺相关病毒介导绿色荧光蛋白基因转染;抗VEGF165单抗免疫组织化学染色及荧光显微镜观察转染效果。 5.人胎儿真皮毛乳头细胞分离培养。显微器械分离法及器 第四军医大学博士学位论文械分离+胶原酶消化二步法分离毛乳头并比较两种方法的效率;有血清DMEM培养基，含生长因子的有血清DMEM培养基以及角质形成细胞条件培养基等3种培养液进行毛乳头细胞的培养并比较细胞生长情况;a一平滑肌肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定毛乳头细胞并与成纤维细胞区别;冻存毛乳头细胞用于裸鼠移植;同法培养成人毛乳头细胞作为对照。 6.毛囊再生试验。以表皮干细胞膜片为重建表皮，以接种毛乳头细胞的胶原纤维凝胶为重建真皮构建组织工程皮肤;组织工程皮肤的体外培养;培养的组织工程皮肤移植修复裸鼠背部全层皮肤缺损创面;术区皮肤病理切片观察再生皮肤结构及毛囊再生情况;抗人角蛋白14鉴定新生皮肤的来源;以角质形成细胞膜片为重建表皮的对照，以接种成纤维细胞的胶原纤维凝胶为重建真皮的对照。 四.研究结果 1.人胎儿角质形成细胞体外可传代培养11一12代，而成人角质形成细胞可传代培养5代;冻存的表皮细胞悬液复苏后培养情况与新鲜标本相同。 2.消化法及组织块法培养的人胎儿成纤维细胞体外生长旺盛，与成人成纤维细胞无明显区别;冻存及复苏操作对细胞生长情况无明显影响。 3.表皮干细胞在W型胶原上孵育10分钟即可贴附，细胞生长缓慢，可形成大克隆;克隆形成率为17.11%，而角质形成细胞为7.33%，有显著差异，P<0.001;细胞周期分析G;期、GZ期和S期细胞分别占93.7%、2.1%和4.2%，而角质形成细胞分别为75.15%、8.3%和16.55%，有显著差异，P<0.001;角蛋白19和