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脂代谢紊乱导致大量脂质在大中动脉中沉积是动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)的主要病理生理学基础，而巨噬细胞摄取过量的修饰脂蛋白，导致细胞内总胆固醇(Total cholesterol ，TC)和甘油三酯(Triglyceride，TG)以脂滴形式积聚并形成泡沫细胞，是发生AS的重要过程。成纤维细胞生长因子21(Fibroblast growth factor 21， FGF21)是一种内分泌因子，可降低血浆TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-c)，并提高高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDL-c)水平，因而具有抗AS潜力。
本课题组前期研究发现FGF21可以减少泡沫细胞中的脂质蓄积，然而，潜在的机制仍不清楚。脂质蓄积是泡沫细胞形成的核心，泡沫细胞的脂滴代谢和胆固醇外流将减少泡沫细胞的形成。因此，深入探讨FGF21调节泡沫细胞脂质代谢的机制对AS的防治具有重要意义。
自噬可以通过酸性脂肪酶降解脂滴，促进胆固醇流出，从而维持脂质代谢平衡；而自噬受损将抑制胆固醇逆转运，促进动脉粥样硬化的发生和发展。因此，本研究的目的是探讨FGF21是否可以通过调节自噬影响巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇代谢抗AS，并探讨其潜在机制。
第一部分：FGF21对高脂饮食apoE-/-小鼠AS病变的影响
【目的】：观察FGF21对高脂饮食apoE-/-小鼠AS病变的影响。
【方法】：60只成年雄性apoE-/-小鼠随机分成4组：(1)对照组：普通正常饮食(Normal diet，ND)；(2)AS1：高脂饮食组，喂食高脂饮食(High fat diet，HFD)；(3)AS2：HFD+腹腔注射(Intraperitoneal, ip)与AS3等量的生理盐水(Normal saline, NS);(4)AS3：HFD+FGF21ip(10mg/kg.d)。每周记录体重和食物摄入量。注射12周后，在戊巴比妥诱导的全身麻醉下处死小鼠并收集血液，检测TC、TG、HDL-c和LDL-c的血浆浓度。苏丹IV染色观察主动脉AS病变。取小鼠主动脉窦作冰冻切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)和油红O染色检测主动脉窦AS病变情况。通过上述动物实验明确FGF21对HFDapoE-/-小鼠血脂谱及AS病变的影响。
【结果】：与对照组相比，AS1、AS2组小鼠血浆TG、TC和LDL-c水平明显升高，HDL-c明显降低(P<0.05)，HE、油红O染色显示小鼠主动脉窦有明显的AS斑块，苏丹IV染色可见主动脉有明显的脂质沉积，提示造模成功，并且腹腔给药途径(NS)对AS病变无明显作用(AS2与AS1比较)。HFD+FGF21组与HFD组相比，其TG、TC和LDL-c较低，HDL-c较高，AS病变面积减少，并且体重低于HFD组。
【结论】：FGF21可改善HFDapoE-/-小鼠脂质谱并抑制apoE-/-小鼠AS病变。
第二部分：FGF21抗动脉粥样硬化的分子机制
【目的】：探讨FGF21抗AS病变的分子机制。
【方法】：首先明确FGF21抗AS的作用是否依赖于调节自噬的作用：90只apoE-/-小鼠分为6组：(1)对照组：ND；(2)AS1:HFD；(3)AS2:HFD+NSip；(4)AS3:HFD+FGF21ip；(5)AS4:HFD+3-MAip(30mg/kg.d)；(6)AS5：HFD+FGF21ip+3-MAip。通过WesternBlot检测自噬相关蛋白，HE和油红O染色检测小鼠AS病变。进而在细胞水平观察FGF21对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞自噬(流)的影响，实验分为四组：(1)对照组；(2)BafA1组(20nM)；(3)FGF21组；(4)FGF21+BafA1组。采用WesternBlot、激光共聚焦检测GFP-LC3、MDC染色和电镜检测分析FGF21对自噬(流)的影响。进一步分析FGF21对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响，FGF21以不同浓度(0-400ng/ml)和不同时间(0-48h)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后通过油红O染色和3H胆固醇标记分析脂质蓄积和胆固醇流出情况。为明确FGF21促进胆固醇流出是否依赖于其调节自噬的作用，采用HPLC、油红O染色和液体闪烁计数测量3H胆固醇含量分析3-MA和ATG5siRNA抑制自噬后脂质蓄积和胆固醇流出的情况。进一步探讨FGF21上调自噬促进胆固醇流出抗AS的作用是否与蛋白激酶C受体1(Receptor for activated C kinase 1，RACK1)有关。首先通过免疫组化、RT-PCR和WesternBlot检测对照组、HFD组、HFD+NSip组和HFD+FGF21ip组apoE-/-小鼠主动脉斑块中RACK1的表达。然后，我们构建了RACK1shRNA慢病毒给予HFD+shRNA组小鼠尾静脉注射，实验结束后通过WesternBlot分析各组小鼠自噬水平，HE染色、油红O染色分析小鼠AS病变情况。然后，在THP-1细胞中转染RACK1siRNA分析RACK1敲低后对自噬(流)和胆固醇流出的影响，通过WesternBlot、激光共聚焦检测GFP-LC3、MDC染色和透射电镜检测自噬(流)，HPLC、油红O染色、液体闪烁计数测量培养基和细胞中的3H胆固醇含量分析泡沫细胞中脂质蓄积和胆固醇流出情况。最后检测FGF21对AMPK磷酸化和ABCA1表达的影响，并明确其作用是否与调节RACK1有关。
【结果】：FGF21ip(AS3)组与HFD组(AS1)比较LC3II/I比率、Beclin1表达增加，P62表达减少；HE和油红O染色结果显示FGF21ip组(AS3)AS病变程度低于HFD组(AS1)。3-MA+FGF21ip(AS5)与FGF21ip组(AS3)比较LC3II/I比率、Beclin1表达水平均减少，P62表达水平增加；而HE和油红O染色结果显示自噬抑制剂3-MA+FGF21ip组(AS5)与FGF21ip组(AS3)相比其AS病变程度明显加重。综合以上结果表明：FGF21可通过上调HFDapoE-/-自噬水平抑制AS，自噬受损削弱FGF21对AS的抑制作用。GFP-LC3、MDC染色和透射电镜测定结果显示FGF21可诱导泡沫细胞中自噬体形成。泡沫细胞与巴弗洛霉素A1共孵育时，LC3-I至LC3-II转化率相对于对照组显著增加。相对于仅用巴弗洛霉素A1或FGF21孵育组，巴弗洛霉素A1+FGF21组的LC3-I至LC3-II转化率进一步增加。因此，这些结果表明FGF21诱导泡沫细胞中的自噬流。HPLC测定结果显示，与对照组相比，200ng/ml和400ng/mlFGF21处理24小时以及200ng/mlFGF21处理24h和48h显著降低TC、FC和CE水平。同时，油红O染色和3H胆固醇测定结果显示FGF21促进泡沫细胞胆固醇流出、抑制脂质蓄积。3-MA或ATG5siRNA干预处理可显著减弱FGF21促进LC3-I向LC3-II转化的作用，并相应增加P62表达。自噬体形成也被3-MA或ATG5siRNA抑制。HPLC检测表明抑制自噬明显减弱FGF21降低TC、FC和CE的作用。油红O染色和胆固醇流出检测结果显示抑制自噬减弱FGF21促进胆固醇流出并减少泡沫细胞中脂质蓄积的作用。与对照组和HFD组相比FGF21腹腔注射的HFDapoE-/-小鼠RACK1蛋白和mRNA水平显著增加。与HFD+FGF21ipapoE-/-小鼠相比，HFD+FGF21ip+RACK1敲低组其LCII/I比率和Beclin1表达水平降低，P62表达水平增加；且与HFD+FGF21ipapoE-/-小鼠相比，RACK1敲低组其AS病变加重。在体外实验中，RACK1siRNA抑制LC3-I向LC3-II的转化以及beclin-1的表达，同时上调P62表达水平，抑制自噬体形成。此外，RACK1敲低明显减弱FGF21对TC、FC和CE水平的降低作用，以及FGF21促进泡沫细胞中胆固醇流出的作用。WesternBlot结果显示FGF21可以活化AMPK增加ABCA1的表达，并且当转染RACK1siRNA后明显减弱FGF21促进AMPK磷酸化和ABAC1表达的作用。上述结果表明，FGF21上调自噬及促进泡沫细胞中胆固醇流出的作用部分依赖于RACK1。
【结论】：FGF21通过上调RACK1促进自噬(流)及泡沫细胞中胆固醇流出抑制apoE-/-小鼠AS病变。
本课题组前期研究发现FGF21可以减少泡沫细胞中的脂质蓄积，然而，潜在的机制仍不清楚。脂质蓄积是泡沫细胞形成的核心，泡沫细胞的脂滴代谢和胆固醇外流将减少泡沫细胞的形成。因此，深入探讨FGF21调节泡沫细胞脂质代谢的机制对AS的防治具有重要意义。
自噬可以通过酸性脂肪酶降解脂滴，促进胆固醇流出，从而维持脂质代谢平衡；而自噬受损将抑制胆固醇逆转运，促进动脉粥样硬化的发生和发展。因此，本研究的目的是探讨FGF21是否可以通过调节自噬影响巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇代谢抗AS，并探讨其潜在机制。
第一部分：FGF21对高脂饮食apoE-/-小鼠AS病变的影响
【目的】：观察FGF21对高脂饮食apoE-/-小鼠AS病变的影响。
【方法】：60只成年雄性apoE-/-小鼠随机分成4组：(1)对照组：普通正常饮食(Normal diet，ND)；(2)AS1：高脂饮食组，喂食高脂饮食(High fat diet，HFD)；(3)AS2：HFD+腹腔注射(Intraperitoneal, ip)与AS3等量的生理盐水(Normal saline, NS);(4)AS3：HFD+FGF21ip(10mg/kg.d)。每周记录体重和食物摄入量。注射12周后，在戊巴比妥诱导的全身麻醉下处死小鼠并收集血液，检测TC、TG、HDL-c和LDL-c的血浆浓度。苏丹IV染色观察主动脉AS病变。取小鼠主动脉窦作冰冻切片，苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)和油红O染色检测主动脉窦AS病变情况。通过上述动物实验明确FGF21对HFDapoE-/-小鼠血脂谱及AS病变的影响。
【结果】：与对照组相比，AS1、AS2组小鼠血浆TG、TC和LDL-c水平明显升高，HDL-c明显降低(P<0.05)，HE、油红O染色显示小鼠主动脉窦有明显的AS斑块，苏丹IV染色可见主动脉有明显的脂质沉积，提示造模成功，并且腹腔给药途径(NS)对AS病变无明显作用(AS2与AS1比较)。HFD+FGF21组与HFD组相比，其TG、TC和LDL-c较低，HDL-c较高，AS病变面积减少，并且体重低于HFD组。
【结论】：FGF21可改善HFDapoE-/-小鼠脂质谱并抑制apoE-/-小鼠AS病变。
第二部分：FGF21抗动脉粥样硬化的分子机制
【目的】：探讨FGF21抗AS病变的分子机制。
【方法】：首先明确FGF21抗AS的作用是否依赖于调节自噬的作用：90只apoE-/-小鼠分为6组：(1)对照组：ND；(2)AS1:HFD；(3)AS2:HFD+NSip；(4)AS3:HFD+FGF21ip；(5)AS4:HFD+3-MAip(30mg/kg.d)；(6)AS5：HFD+FGF21ip+3-MAip。通过WesternBlot检测自噬相关蛋白，HE和油红O染色检测小鼠AS病变。进而在细胞水平观察FGF21对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞自噬(流)的影响，实验分为四组：(1)对照组；(2)BafA1组(20nM)；(3)FGF21组；(4)FGF21+BafA1组。采用WesternBlot、激光共聚焦检测GFP-LC3、MDC染色和电镜检测分析FGF21对自噬(流)的影响。进一步分析FGF21对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出的影响，FGF21以不同浓度(0-400ng/ml)和不同时间(0-48h)处理THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞后通过油红O染色和3H胆固醇标记分析脂质蓄积和胆固醇流出情况。为明确FGF21促进胆固醇流出是否依赖于其调节自噬的作用，采用HPLC、油红O染色和液体闪烁计数测量3H胆固醇含量分析3-MA和ATG5siRNA抑制自噬后脂质蓄积和胆固醇流出的情况。进一步探讨FGF21上调自噬促进胆固醇流出抗AS的作用是否与蛋白激酶C受体1(Receptor for activated C kinase 1，RACK1)有关。首先通过免疫组化、RT-PCR和WesternBlot检测对照组、HFD组、HFD+NSip组和HFD+FGF21ip组apoE-/-小鼠主动脉斑块中RACK1的表达。然后，我们构建了RACK1shRNA慢病毒给予HFD+shRNA组小鼠尾静脉注射，实验结束后通过WesternBlot分析各组小鼠自噬水平，HE染色、油红O染色分析小鼠AS病变情况。然后，在THP-1细胞中转染RACK1siRNA分析RACK1敲低后对自噬(流)和胆固醇流出的影响，通过WesternBlot、激光共聚焦检测GFP-LC3、MDC染色和透射电镜检测自噬(流)，HPLC、油红O染色、液体闪烁计数测量培养基和细胞中的3H胆固醇含量分析泡沫细胞中脂质蓄积和胆固醇流出情况。最后检测FGF21对AMPK磷酸化和ABCA1表达的影响，并明确其作用是否与调节RACK1有关。
【结果】：FGF21ip(AS3)组与HFD组(AS1)比较LC3II/I比率、Beclin1表达增加，P62表达减少；HE和油红O染色结果显示FGF21ip组(AS3)AS病变程度低于HFD组(AS1)。3-MA+FGF21ip(AS5)与FGF21ip组(AS3)比较LC3II/I比率、Beclin1表达水平均减少，P62表达水平增加；而HE和油红O染色结果显示自噬抑制剂3-MA+FGF21ip组(AS5)与FGF21ip组(AS3)相比其AS病变程度明显加重。综合以上结果表明：FGF21可通过上调HFDapoE-/-自噬水平抑制AS，自噬受损削弱FGF21对AS的抑制作用。GFP-LC3、MDC染色和透射电镜测定结果显示FGF21可诱导泡沫细胞中自噬体形成。泡沫细胞与巴弗洛霉素A1共孵育时，LC3-I至LC3-II转化率相对于对照组显著增加。相对于仅用巴弗洛霉素A1或FGF21孵育组，巴弗洛霉素A1+FGF21组的LC3-I至LC3-II转化率进一步增加。因此，这些结果表明FGF21诱导泡沫细胞中的自噬流。HPLC测定结果显示，与对照组相比，200ng/ml和400ng/mlFGF21处理24小时以及200ng/mlFGF21处理24h和48h显著降低TC、FC和CE水平。同时，油红O染色和3H胆固醇测定结果显示FGF21促进泡沫细胞胆固醇流出、抑制脂质蓄积。3-MA或ATG5siRNA干预处理可显著减弱FGF21促进LC3-I向LC3-II转化的作用，并相应增加P62表达。自噬体形成也被3-MA或ATG5siRNA抑制。HPLC检测表明抑制自噬明显减弱FGF21降低TC、FC和CE的作用。油红O染色和胆固醇流出检测结果显示抑制自噬减弱FGF21促进胆固醇流出并减少泡沫细胞中脂质蓄积的作用。与对照组和HFD组相比FGF21腹腔注射的HFDapoE-/-小鼠RACK1蛋白和mRNA水平显著增加。与HFD+FGF21ipapoE-/-小鼠相比，HFD+FGF21ip+RACK1敲低组其LCII/I比率和Beclin1表达水平降低，P62表达水平增加；且与HFD+FGF21ipapoE-/-小鼠相比，RACK1敲低组其AS病变加重。在体外实验中，RACK1siRNA抑制LC3-I向LC3-II的转化以及beclin-1的表达，同时上调P62表达水平，抑制自噬体形成。此外，RACK1敲低明显减弱FGF21对TC、FC和CE水平的降低作用，以及FGF21促进泡沫细胞中胆固醇流出的作用。WesternBlot结果显示FGF21可以活化AMPK增加ABCA1的表达，并且当转染RACK1siRNA后明显减弱FGF21促进AMPK磷酸化和ABAC1表达的作用。上述结果表明，FGF21上调自噬及促进泡沫细胞中胆固醇流出的作用部分依赖于RACK1。
【结论】：FGF21通过上调RACK1促进自噬(流)及泡沫细胞中胆固醇流出抑制apoE-/-小鼠AS病变。