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目的以往的多项研究证明,缺血预处理(Ischemic preconditioning IPC)对大鼠小肠移植后供体小肠所受缺血再灌注损伤(Ischemic reperfusion I/R)存在显著的保护作用。而炎症反应和移植手术带来的I/R损伤可能是加重急性排斥反应(Acute cell rejection AR)及菌群易位(Bacterial Translocation BT)的重要原因之一。那么,IPC对大鼠小肠移植后发生的急性排斥反应及菌群易位是否也存在保护作用?本实验目的旨检验这个推论。方法1.动物模型的建立与实验分组Andrea Ferencz等在实验中证实:2min缺血后继以2min再灌注的IPC方案足以触发保护机制,本实验参照此方案,以Wistar大鼠为供体(188.4±23.6g),Brown-Norway大鼠为受体(198.0±29.2g)建立原位异基因小肠移植模型。实验选取术后第4天、第7天两个观察点,分别观察小肠移植后排斥反应的初期和进展期。随机选取体重相当的大鼠配对并分为4组,IPC4d和Ctrl4d、IPC7d和Ctrl7d。在IPC4d组中(n=7),取下供体小肠之前先进行缺血预处理:以无创显微血管钳钳闭供体小肠肠系膜上动脉(Superior mesentery artery SMA),使供体小肠经历2分钟缺血,紧接着松开血管钳,进行2分钟再灌注。IPC结束后立即夹闭SMA上方的腹主动脉阻断动脉血流,剪断门静脉,以4℃肝素凌格氏液经动脉灌洗小肠血管系统使供肠降温。移植完成之后第4日处死受体采集标本。在IPC7d (n=7)组中,同样采用上述2min-2min IPC方案,受体在第7天被处死。同时实验设立两组对照组:Ctrl4d(n=7)、Ctrl7d(n=7),进行同样的移植手术,但不进行IPC,分别在第4、第7日处死受体采集标本。2.手术方式与标本采集供体手术:实验动物在异氟烷持续吸入麻醉下接受相对无菌移植手术。取供体大鼠屈氏韧带下5至6cm至回盲瓣以上3至4cm之间的全部空回肠,约占全小肠的80%。手术将供体小肠充分游离,仅由带有主动脉袖的肠系膜上动脉和门静脉与供体大鼠相连,此时术者随机决定是否进行IPC。IPC结束后立即夹闭SMA上方的腹主动脉阻断动脉血流,剪断门静脉,以4℃肝素凌格氏液(含低分子量肝素10 units/ml)经动脉灌洗小肠血管系统使供肠降温,直至供肠颜色雪白,紧接着用湿纱布包裹供体小肠贮藏在4℃冷凌格液中。与此同时进行受体手术。受体手术:先以连续端-侧吻合门静脉-下腔静脉,紧接着以连续褥式端-侧吻合主动脉袖-腹主动脉。供体血液循环重新建立后,将供肠纳入腹腔,与此同时切除受体大鼠80%自体小肠肠管,保留20%自体小肠以便观察对照。消化道连续性由两个供体受体肠管之间的端-端吻合达成。受体术后放置于电热毯上直到从麻醉中完全苏醒。禁水2小时,禁食24小时后恢复正常喂养。按照实验设计分别于手术后第4日、第7日在深麻醉下处死受体大鼠,无菌条件下采集腔静脉血液标本7ml左右,4ml全血标本分别注入需氧菌、厌氧菌细菌培养瓶内进行培养,其余全血在4℃下以3000rd/min离心5分钟,以采集血浆标本用于免疫化学分析。采集近端吻合口前方受体自身回肠,以及吻合口后方供体回肠肠管,全部肺脏,肝脏,各取适当大小组织块置于5ml无菌离心管内,液氮急冻以备免疫化学分析。其余组织置于10%福尔马林中固定,做组织学检测。3.组织学分别记录肺、肝的全重。肝脏、肺脏和小肠的固定标本经脱水、包埋后,切片5μm,苏木精-伊红常规染色,检查病理损伤。依照临床小肠移植建立的评分系统进行小肠急性细胞排斥反应评分。在供体小肠和自体小肠切片低倍镜视野中随机选择30个点测量绒毛高度和陷窝深度,在5个随机高倍视野中计数细胞分裂相,以上均由两位作者用盲法重复测量。4.免疫化学IL-1β与TNFα是经典的参与炎症、免疫反应的细胞因子,他们在组织及循环中的浓度与免疫活动相关;MPO是中性粒细胞颗粒的主要成分,他在组织中的浓度代表着中性粒细胞密度。本实验以双抗体夹心法进行酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immune Sorbent Assay ELISA)测定血浆和组织匀浆中TNFα(eBioscience 88-7340)和IL-1β(eBioscience 88-6010)的水平以及组织匀浆中MPO(Hycult Biotechnology B.V. HK105)活性,试图从免疫化学的角度估计急性排斥反应严重程度。所有实验操作都严格依照试剂盒提供的说明书进行。5.微生物学大鼠移植术后菌血症的持续状态意味着菌群易位的发生。采集循环血样分别注入厌氧菌和需氧菌血培养瓶内(BacT/ALERT? 3D Microbial Detection System Ref:259791, 259793 Biomerieux Inc.),置于自动孵育器内孵育5日,如果每毫升血样有大于等于100个菌落生长,则视为培养阳性,既无阳性菌又无阴性菌生长的视为培养阴性。结果1.移植手术成功率实验动物术后3日内死亡则被视为手术失败,经过适当的移植训练,成功率达到84.6% (78例中66例成功)。2.组织学各组的器官重量没有显著区别。在显微镜下观察肝、肺的HE切片,未见任何有意义的病理改变,各组差别不明显。小肠急性排斥反应评分:第4日的IPC组和相应的对照组间AR评分没有显著差异,第7日的IPC组比对照组获得较高的评分,但是差异不显著。各组供体小肠与自体小肠绒毛高度和陷窝深度无显著性差异。粘膜细胞分裂相计数各组之间差异不显著。3.细胞因子免疫化学TNFα:手术后第4日,IPC4d组接受预处理以后,自体小肠组织内的TNFα水平与对照组相比显著增高(P<0.05)。手术后第7日,IPC7d实验组与对照组相比,自体小肠内的TNFα水平都显著增高(P<0.05),而供体小肠内的TNFα水平在各组之间都没有显著性差异。在第4日与第7日,IPC4d组与IPC7d组TNFα血清浓度都较其它组显著的提高了(P<0.05)。IL-1β:手术后第4日的IL-1β水平在供体自体小肠组织内都没有显著区别,但是第7日,2min预处理使供体小肠内的IL-1β显著升高(P<0.05)。第4日,各组血浆IL-1β水平没有显著区别,第7日,2min预处理明显的降低了血浆IL-1β水平(P<0.05)。4.髓过氧化物酶(MyeloperoxidaseMPO)分析中性粒细胞是急性排斥反应的效应细胞之一,髓过氧化物酶(MyeloperoxidaseMPO)主要存在于中性粒细胞中,实验通过ELISA分析MPO水平来推断小肠急性排斥反应过程中中性粒细胞浸润组织的情况。移植后的第4日,各组供体小肠和自体小肠中MPO的水平很相似。而第7日时,2minIPC的供体小肠中MPO的含量显著的降低了(P<0.05)。5.微生物学术后早第4日,IPC4d组与对照组相比,系统血标本细菌的培养阳性率,尤其是格兰氏阴性菌的培养阳性率,显著的降低了(P<0.05),这显示出2minIPC在早期对菌群易位具有一定的防止作用。而急性排斥反应显著的时候(第7日),IPC无法改变细菌培养的结果。结论1、IPC明显降低了术后第7日供体小肠组织中MPO的含量,这表明IPC能显著抑制小肠移植后急性排斥反应进展期供肠内的中性粒细胞聚集。2、IPC显著降低了术后第4日循环血液标本细菌培养阳性率,可以推论IPC在急性排斥反应早期能有效地减少菌群易位的发生。3、无论是从组织病理学还是从细胞因子角度观察,IPC处理后各观察点急性排斥反应没有明显被控制的趋势。