论文部分内容阅读
研究水稻颖花的育性机理对于水稻生产具有重要意义。本研究通过60Co-γ诱变获得了一个以中恢8015为背景的无花粉型雄性不育突变体baymax1（bm1）。应用花药半薄切片、透射电镜和扫描电镜等方法鉴定了其不育成因,并通过图位克隆、互补和敲除验证和TUNEL检测等实验研究了该雄性不育基因的功能。主要结果如下:1.通过表型观察发现突变体bm1营养生长正常,单压片镜检结果显示其花药内无可见花粉。2.半薄切片和透射电镜结果显示,突变体bm1中绒毡层在花药发育的第9时期不能向分泌型绒毡层转化,第10时期其胞质内细胞器几乎完全降解,不能合成乌氏体,小孢子不能合成花粉壁,并逐渐降解。3.扫描电镜结果显示,突变体bm1花药壁外表面蜡质结构异常,花药壁内表面和花粉壁表面无排列整齐的颗粒结构。这些结果表明突变体bm1的绒毡层发育与降解异常,不能合成乌氏体,使得小孢子后期发育营养供给不足,最终降解。4.BM1被精细定位于4号染色体上4MD-6与4MD-11之间17.9 kb内。基因注释信息分析和测序分析显示突变体bm1在第4个ORF（LOCOs04g39470）的第2个外显子上有一个A→T的替换,导致其氨基酸从谷氨酸变成了缬氨酸。互补验证和敲除鉴定结果表明确实是BM1（即OsMYB103）的突变造成了突变体bm1的雄性不育。5.表达谱分析结果显示,BM1 5?端启动子启动其在花药中特异表达,从第5时期开始表达,在第6时期表达最强,在第10时期晚期仍有微弱表达。序列分析和系统发育分析结果显示BM1编码一个R2R3类MYB转录因子,其在多个物种中的同源基因都具有调控花药发育的功能。转录激活活性分析结果显示,BM1确实具有转录激活活性,其C末端的64个氨基酸是主要的激活域。6.TUNEL检测和石蜡切片DAPI染色结果显示,BM1与其拟南芥同源基因AtMYB103一样,反向调控绒毡层的降解。但胼胝质鉴定结果显示,BM1并不像AtMYB103一样调控小孢子生成过程中的胼胝质合成与降解。这说明BM1的功能在进化过程既有一定的保守性,又存在一定的变异。7.综合qRT-PCR结果和相关基因变异产生的表型缺陷分析,表明BM1可能位于MSP1和UDT1的下游,与GAMYB、TDR平行反向调控下游绒毡层降解相关基因的表达和协同调控花粉壁形成相关基因的表达。另一方面,本研究通过反向遗传学方法获得了结实率低的low seed setting rate1（lssr1）突变体株系,并对其结实率低的成因进行了分析。主要结果如下:1.LSSR1是一个花药特异表达基因,主要在减数分裂前期至单细胞花粉期的小孢子生成期间表达。预测LSSR1编码一个GH5类纤维素酶,具有12个活性位点,包括GH5蛋白特有的酸/碱中心和亲核中心,其N端有一段信号肽。2.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除LSSR1后获得一系列结实率降低的lssr1突变体株系。共分离分析、遗传学分析和多位点单独敲除结果证实LSSR1突变确实是lssr1株系结实率降低的原因。3.lssr1株系其它性状与野生型无显著差异,其雌雄蕊形态及花粉I2-KI染色也都正常。花粉管体内萌发实验结果表明,受精异常是lssr1株系结实率低的主要原因。lssr1株系受精受阻可能主要由其花粉萌发异常、花粉管穿透失败和生长停滞造成。这些结果表明LSSR1对于水稻正常受精及保障其正常结实是必不可少的。本研究中这两个基因及其功能研究将有利于我们进一步理解水稻育性的分子机制,为保障和提高水稻产量及利用杂种优势奠定理论基础。