粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)是脉孢菌属的一种多细胞丝状真菌,其菌丝透明,并有分隔和分枝,菌丝疏松,呈网状,能产生桔色分生孢子。粗糙脉孢菌生长快,易培养,遗传背景清晰,所以是实验室普遍使用的模式真菌。前期研究发现,粗糙脉孢菌通过合成组成性毒素(constitutive toxins,CT)来抵御昆虫,并形成特定的亚细胞结构储存组成性毒素,避免对自身细胞造成伤害。利用antiSMASH预测,粗糙脉孢菌中合成组成性毒素的基因PKS5(polyketide synthase gene,PKS5)和编码短链脱氢酶还原酶(DH)、转运蛋白超家族(MFS-1,MFS-2)、细胞色素450(CYP-1,CYP450-2)、转录因子(TF)、硫酸根转运蛋白(SULT)等9个基因共同构成了组成性毒素合成基因簇(CTNC)。CYP450是真菌体内含量最多、功能最多的活性蛋白酶,能够降解外源毒物以及自身有毒次级代谢产物。MFS参与调控,能够将菌体产生的毒素排到细胞外发生作用。SULT将硫酸根转运到胞内发生同化反应,合成半胱氨酸,参与电位的调节。转录因子在细胞基因表达过程中起着双重调控作用:1.对丝状真菌次级代谢产物进行调节;2.对不利于自身的外来活性氧自由基信号传导作出反应。在本论文中,开展了以下研究:1.以粗糙脉孢菌Ku70突变株为出发菌株,将CTNC基因簇中的10个基因分别敲除,获得10个突变菌株,通过薄层层析(TLC)检测代谢产物变化情况。2.克隆基因PKS5并将其与pYH-WA-pyrG-KI载体连接,整合到模式真菌构巢曲霉的WA位点,通过PCR技术筛选突变菌株,并对其次级代谢产物进行检测。3.以cDNA为模板克隆TF基因,并将其与pETMALc-H载体连接,转化大肠杆菌蛋白表达菌株BL21,诱导蛋白表达,获得相应蛋白。用获得的蛋白作为抗原注射家兔,从家兔的血清中获得抗体。4.以粗糙脉孢菌Ku70突变株为出发菌株,对其TF基因进行原位超强表达,提取蛋白,通过Western Blot检测TF基因的蛋白表达水平,TLC检测次级代谢产物合成水平。结果显示,粗糙脉孢菌的10株突变菌株中有4株颜色变为白色且不产生孢子,说明被敲除基因与孢子的形成有密切联系。通过TLC检测得出,突变菌株次级代谢产物数量减少。粗糙脉孢菌的PKS5基因整合到构巢曲霉基因组WA位点后成功表达,TLC和HPLC检测结果显示,突变型构巢曲霉的次级代谢产物中有3种新物质产生。大肠杆菌BL21成功表达出转录因子,并通过注射家兔获得相应抗体。提取TF超强表达菌株蛋白,Western Blot结果显示TF超强表达菌株中TF基因的表达水平显著上调,TLC检测显示次级代谢产物的生成量显著增加。