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研究背景宫颈癌是世界范围内严重影响女性健康的重要公共卫生问题,其发病机制是癌症领域研究重点和难点,迄今为止尚无突破性进展。随着全球宫颈癌发病率与病死率在女性恶性肿瘤中仍居高不下且年轻化趋势明显,宫颈癌细胞（增殖、迁移、侵袭、有氧糖酵解和铁死亡抵抗）等恶性行为仍是晚期和转移宫颈癌患者预后不良的主要原因,因此研究其发生发展机制彰显重要。本研究以此为切入点深入研究宫颈癌恶性行为相关机制,有助于发现宫颈癌新靶点,对干预宫颈癌细胞恶性演进有重要科学意义。人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）感染是宫颈癌的主要病因,p53蛋白降解被认为是与HPV感染有关的宫颈癌癌变的发病机制。作为高迁移率族盒（High mobility group box,HMGB）蛋白家族的成员之一,HMGB2参与多种肿瘤基因转录和DNA修复。尤其在宫颈癌中,HMGB2干扰宫颈癌细胞p53降解使宫颈癌细胞周期停滞在G1期,通过上调或下调宫颈癌细胞内HMGB2表达可调节p53蛋白依从性变化,提示研究HMGB2在调控宫颈癌恶性进展中的作用至关重要。越来越多的证据表明,HMGB2作为一种重要的致癌基因在多种恶性肿瘤中表达上调与肿瘤恶性行为密切相关。HMGB2在宫颈鳞癌组织中高表达促进宫颈癌细胞周期进展并通过激活AKT信号通路加速宫颈癌细胞增殖,提示HMGB2可能是宫颈癌进展的关键靶基因,有望成为宫颈癌新的靶点。然而目前HMGB2在宫颈癌中作用机制未见报道。因此本论文拟通过寻找调控HMGB2上游关键靶基因阐述其调控机制,为开发宫颈癌的临床诊疗新策略提供理论依据,具有研究价值和意义。微小RNA（Micro RNA,MiRNA）是一种小型非编码RNA,通过与目标m RNA的互补核苷酸序列配对,调节蛋白质编码基因的表达水平,特异性地阻止m RNA翻译或使其降解。据《cell》最新报道,肿瘤中存在异常miRNAs异构体的广泛积累,通过编辑和修复有缺陷的miRNAs能够实现广泛的抗肿瘤效应。因此,探究miRNA调控机制有希望为宫颈癌治疗提供潜在新策略。MiR-181a-5p作为miRNA家族的一员,已被报道参与多种癌症的增殖、迁移、细胞周期、上皮间质转化、化疗抵抗和有氧糖酵解途径,但miR-181a-5p在宫颈癌中的研究仍处于初级阶段,miR-181a-5p在宫颈癌的潜在应用价值需要进一步的开发。本课题组通过前期高通量测序结合数据库预测分析发现与HMGB2 3’-UTR存在结合位点并可能存在负向调控关系的miRNA为miR-181a-5p。据此,我们提出如下假说:“miR-181a-5p靶向结合并负向调控HMGB2表达抑制宫颈癌细胞恶性行为进展”。因此本研究拟采用宫颈癌He La、Si Ha细胞和裸鼠移植瘤模型,以miR-181a-5p与HMGB2的靶向结合及负向调控关系为切入点探究其对宫颈癌细胞（增殖、迁移、侵袭、有氧糖酵解和铁死亡抵抗）恶性行为的影响,为miR-181a-5p和HMGB2在宫颈癌临床诊疗的潜在应用提供新思路和理论基础。本研究工作分如下三个部分进行:第一部分高迁移率族蛋白B2促进宫颈癌恶性行为相关机制研究目的探究HMGB2在宫颈癌的表达与临床病理参数和生存期的关系以及HMGB2对宫颈癌增殖、迁移、侵袭和糖酵解的影响。方法1.生物信息分析:TCGA和人类蛋白质图谱HPA数据库分析泛癌组织HMGB2 m RNA和蛋白表达;GEPIA数据库分析宫颈癌组织和正常子宫颈组织HMGB2 m RNA表达;TCGA数据库分析HMGB2表达与宫颈癌患者的临床病理参数之间的关系;CCLE数据库分析宫颈癌细胞株HMGB2 m RNA的表达。2.宫颈癌组织芯片:q RT-PCR和Western Blot实验检测HMGB2在宫颈癌组织芯片的表达,χ2检验分析HMGB2表达与宫颈癌患者临床病理参数之间的关系;Kaplan-Meier法绘制生存曲线,Log rank检验分析HMGB2蛋白表达与患者生存期之间的关系。3.体外实验:q RT-PCR和Western Blot实验检测HMGB2在宫颈癌细胞系的表达;慢病毒转染技术构建HMGB2过表达和敲低的宫颈癌He La和Si Ha稳转株;CCK8、平板克隆形成、细胞划痕修复、Transwell实验检测HMGB2和糖酵解抑制剂2-DG对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响;葡萄糖摄取和乳酸生成实验分析HMGB2和糖酵解抑制剂2-DG对宫颈癌细胞糖酵解能力的影响;Western Blot实验检测HMGB2与宫颈癌细胞中GLUT-1、乏氧诱导因子HIF-1α和糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA表达水平的相关性。结果1.生物信息分析结果:HMGB2在宫颈癌组织表达高于子宫颈正常组织;HMGB2表达与宫颈癌患者临床分期密切相关,与患者年龄、肿瘤分级和淋巴结转移无显著性差异。2.宫颈癌组织芯片结果:HMGB2在宫颈癌组织表达上调,HMGB2与宫颈癌患者的临床分期及淋巴结转移密切相关,HMGB2高表达患者的总生存期更低。3.体外实验结果:HMGB2在宫颈癌He La和Si Ha细胞系中表达上调;过表达HMGB2宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解能力更强,敲低HMGB2表达得到相反的结果;过表达HMGB2的宫颈癌细胞中GLUT-1、乏氧诱导因子HIF-1α和糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA的表达更高,敲低HMGB2表达得到相反的结果;在过表达HMGB2的同时加入糖酵解抑制剂2-DG能够逆转HMGB2对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解的影响。结论1.HMGB2在宫颈癌中高表达与患者预后不良密切相关。2.HMGB2通过增强糖酵解能力促进宫颈癌的增殖、迁移和侵袭。第二部分MiR-181a-5p负向调控高迁移率族蛋白B2表达抑制宫颈癌恶性行为相关机制研究目的探究miR-181a-5p与HMGB2之间靶向结合和调控关系对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法1.生物信息分析:Target Scan和ENCORI数据库检索分析结合课题组前期测序结果,对数据进行Venn分析,筛选与HMGB2靶向结合并与之存在调控关系的miRNA。2.体外实验:q RT-PCR实验检测miR-181a-5p在宫颈癌细胞系的表达;慢病毒转染技术构建miR-181a-5p过表达和敲低的宫颈癌He La和Si Ha稳转株;Western Blot和IF实验检测miR-181a-5p与HMGB2的调控关系;双荧光素酶实验验证miR-181a-5p与HMGB2之间的靶向结合;CCK8、平板克隆形成、细胞划痕修复、Transwell实验验证miR-181a-5p对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响;Western Blot实验检测miR-181a-5p与宫颈癌细胞中GLUT-1、乏氧诱导因子HIF-1α和糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA表达水平的相关性。3.体内实验:构建宫颈癌裸鼠移植瘤模型,测量瘤体长短径计算移植瘤体积并绘制生长曲线,检测miR-181a-5p对裸鼠移植瘤体积增长的影响;HE染色验证miR-181a-5p对裸鼠移植瘤形成的作用;免疫组化染色检测miR-181a-5p对裸鼠移植瘤HMGB2和Ki67蛋白表达的影响。结果1.生物信息分析:筛选出靶向HMGB2 3’-UTR并与之存在负向调控关系的miRNA为miR-181a-5p。2.体外实验结果:miR-181a-5p在宫颈癌He La和Si Ha细胞系中表达下调。过表达miR-181a-5p的宫颈癌细胞中HMGB2表达下降,HMGB2 3’-UTR野生型的报告基因活性降低。过表达miR-181a-5p宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,敲低miR-181a-5p得到相反的结果。过表达HMGB2的同时过表达miR-181a-5p能够逆转HMGB2对宫颈癌增殖、迁移和侵袭的影响。3.体内实验结果:成功构建了宫颈癌裸鼠移植瘤模型;过表达miR-181a-5p抑制了裸鼠移植瘤的形成,移植瘤体积增长明显更少;过表达miR-181a-5p的宫颈癌裸鼠移植瘤中HMGB2和Ki67的表达降低。结论1.HMGB2是miR-181a-5p的直接作用靶点。2.MiR-181a-5p通过负向调控HMGB2的表达抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移、侵袭和裸鼠体内成瘤能力。第三部分MiR-181a-5p通过调节糖酵解介导Erastin诱导的宫颈癌铁死亡目的探究Erastin能否诱导宫颈癌细胞铁死亡,miR-181a-5p对宫颈癌糖酵解和铁死亡的影响。方法葡萄糖摄取和乳酸生成实验检测miR-181a-5p对宫颈癌细胞的糖酵解能力的影响;Western Blot实验检测过表达和敲低miR-181a-5p对GLUT-1、乏氧诱导因子HIF-1α和糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA表达水平的影响。光学显微镜观察miR-181a-5p和糖酵解抑制剂2-DG对Erastin诱导宫颈癌细胞铁死亡形态变化的影响。CCK8实验验证miR-181a-5p和糖酵解抑制剂2-DG对Erastin诱导的宫颈癌细胞生存率的影响。Fe2+浓度测定验证miR-181a-5p和糖酵解抑制剂2-DG对Erastin诱导的Fe2+浓度变化的影响。Western Blot实验检测miR-181a-5p和糖酵解抑制剂2-DG对Erastin诱导的抗氧化酶GPX4表达的影响。流式细胞术检测miR-181a-5p和糖酵解抑制剂2-DG对Erastin诱导的lipid ROS产生的影响。JC-1检测miR-181a-5p和糖酵解抑制剂2-DG对Erastin诱导的宫颈癌细胞线粒体膜电位变化的影响。结果过表达miR-181a-5p的宫颈癌细胞葡萄糖消耗和乳酸生成量减少,敲低miR-181a-5p得到相反的结果;过表达miR-181a-5p的宫颈癌细胞中GLUT-1、乏氧诱导因子HIF-1α和糖酵解关键酶HK2、PKM2、LDHA表达水平下降,敲低miR-181a-5p得到相反的结果。Erastin诱导宫颈癌细胞死亡形态变化、细胞生存率降低、Fe2+积累、抗氧化酶GPX4表达降低、lipid ROS产生增加和线粒体膜电位下降;在加入Erastin的同时敲低miR-181a-5p逆转Erastin诱导的宫颈癌细胞铁死亡形态变化和细胞生存率降低,抑制宫颈癌细胞Erastin诱导的Fe2+积累、线粒体损伤、lipid ROS产生增加和抗氧化酶GPX4的表达降低;在加入Erastin、敲低miR-181a-5p的同时加入糖酵解抑制剂2-DG可抵消miR-181a-5p对宫颈癌细胞铁死亡的影响。结论1.铁死亡诱导剂Erastin可诱导宫颈癌细胞死亡,伴随着Fe2+积累、抗氧化酶GPX4失活、脂质过氧化程度上升和线粒体损伤。2.MiR-181a-5p通过调节糖酵解能力促进Erastin诱导的宫颈癌细胞铁死亡。创新点1.确证HMGB2通过增强糖酵解能力促进宫颈癌增殖、迁移和侵袭。2.铁死亡诱导剂Erastin可诱导宫颈癌细胞死亡,抗氧化酶GPX4失活、脂质过氧化程度上升和线粒体损伤。MiR-181a-5p通过调节糖酵解能力促进Erastin诱导的宫颈癌细胞铁死亡。3.发现并确证MiR-181a-5p通过靶向调节高迁移率族蛋白B2表达在宫颈癌细胞恶性行为的重要作用,可能是介导其恶性进展的新机制,具有原创性意义。