蚊传播多种疾病,包括疟疾、登革热、日本脑炎等,严重危害人类健康。防制蚊媒可有效阻断蚊媒病的传播,化学防制是当前蚊媒防制的主要手段之一。然而随着杀虫剂长期、大量的使用,导致蚊产生抗药性,严重影响杀虫剂的有效使用。阐明抗药性机制可为抗药性的治理提供理论依据。代谢抗性是重要的抗药性机制之一,主要与蚊体内代谢杀虫剂等外源性物质的酶类有关。其中,细胞色素P450是主要的代谢解毒酶之一。实验室前期,以淡色库蚊溴氰菊酯敏感品系（DS）和抗性品系（DR）为材料,通过iTRAQ联合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等方法,筛选出差异蛋白CYP6AA9,并验证了蛋白CYP6AA9的差异表达与蚊抗药性有关。在此基础上,本研究将抗药性基因CYP6AA9重组到pET20b表达载体,体外表达。由于P450的代谢需要细胞色素还原酶（CPR）和细胞色素b₅因子（cytb₅）提供电子才能完成,因此通过pACYCD-1表达载体,将CPR、cytb₅同CYP6AA9共表达。通过IPTG诱导重组蛋白表达,制备含3个重组蛋白的活性膜成分,同溴氰菊酯反应,液相色谱检测溴氰菊酯的降解。本研究分别扩增淡色库蚊CYP6AA9、CPR和cytb₅全长序列,构建重组质粒pET20b/CYP6AA9和pACYCD-1/CPR/cytb₅,测序结果显示重组质粒构建成功。将两个质粒共转化入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导重组蛋白表达。根据基因序列推断,CYP6AA9蛋白分子量大小约为57kDa,Western Blot显示蚊CYP6AA9重组蛋白表达成功。CPR、cytb₅蛋白的分子量大小分别约为75kDa、35kDa,Western Blot显示CPR、cytb₅重组蛋白也表达成功。随后,制备含3个重组蛋白的活性膜成分,分别用Western Blot鉴定和CO差示法和氧化还原法测定膜成分中重组蛋白含量。将活性膜成分与不同浓度的溴氰菊酯（0.5mg¹0.5mg）混合反应,并通过HPLC检测。检测结果显示,CYP6AA9重组蛋白可以体外直接降解溴氰菊酯,并产生两个新的物质。随着溴氰菊酯浓度升高,降解产物的量随之增加;但当增加溴氰菊酯浓度超过3.5mg之后,降解产物的量不再增加,而未降解的溴氰菊酯的量随之增加。随后测定CYP6AA9重组蛋白降解溴氰菊酯的时间效应。将活性膜成分与3.0mg溴氰菊酯混合反应,分别在1min、2min、3min、4min、5min、10min和15min中止反应,HPLC检测溴氰菊酯的降解。检测结果显示,CYP6AA9表达蛋白能在4⁵min的时间内完成对溴氰菊酯的降解。本实验重组表达蚊CYP6AA9蛋白,并验证了CYP6AA9对溴氰菊酯的直接降解作用。本研究结果深化了对蚊抗药性机制的认识,为治理蚊抗药性提供了新的靶点。此外,CPR和cytb₅同P450基因共表达,为P450家族其它成员的体外研究提供了实验依据。