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1.研究背景与目的骨髓间充质干细胞是位于骨髓内的具有自我更新能力及多能性的成体干细胞,在一定的条件下,可分化为具有成熟功能的肝细胞,并且已经得到了动物实验及临床实验的证实。课题组研究人员潘润华曾对大鼠骨髓间充质干细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中OCT4的表达及其启动子区的甲基化变化进行观察,发现OCT4的表达量和启动子区甲基化频率随分化进程的不同而变化。而Oct4与Klf4、Nanog等是一组多潜能性基因,在维持干细胞的多能性方面起着重要作用。因此基于潘润华等人员的成果上,本研究主要观察Klf4和Nanog在这个分化过程中的表达变化及其启动子区的甲基化变化,以期更加全面的认识骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的表观遗传学调控机制。2.材料与方法2.1实验主要试剂及仪器高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司);EpiTect Bisulfite Kit,甲基化转化试剂盒(德国Qiagen公司):0.25%胰酶-EDTA(美国Gibco公司);Gel Extraction Kit,琼脂糖凝胶回收试剂盒(美国Omega公司);重组人肝细胞生长因子(美国Peprotech公司);澳洲特级胎牛血清(以色列BioInd公司);TaKaRa EpiTaq HS,PCR用扩增酶(Takara公司);青霉素-链霉素(美国Gibco公司);Biospin细胞基因组DNA提取试剂盒(杭州博日科技公司);RNasin,特异性核糖核酸酶抑制剂(美国Promega公司);RT-PCR试剂(德国DBI公司);地塞米松(美国Gibco公司);.Trizol,RNA提取试剂(日本Takara公司);逆转录试剂盒(德国DBI公司)。紫外分光光度计UV-1206(日本SHIMODZU公司);凝胶扫描系统DF-23B(英国 UVP公司);Stratagene Mx3000P Real time PCR仪(美国Agilent公司);ABI9700PCR扩增仪(美国ABI公司)2.2实验细胞课题组之前已成功提取了 vista雄性大鼠骨髓间充质干细胞,通过免疫磁珠阴、阳分选法获得了表达CD90+Lin-表面抗原的细胞,即大鼠CD90+Lin-骨髓间充质干细胞。2.3实验方法2.3.1冻存细胞复苏、培养及定向诱导分化将冻存的大鼠CD90+Lin-骨髓间充质干细胞复苏后,将其置于孵箱中培养,培养液为高糖培养液(高糖DMEM培养基+胎牛血清+青霉素-链霉素),每3天换液1次,细胞生长到约80%的时候用0.25%胰酶-EDTA消化传代。按照课题组研究人员潘润华所报道的方案。把细胞培养至第三代的良好细胞,置入培养液(高糖DMEM培养基+胎牛血清+青霉素-链霉素+25 μg/L重组人肝细胞生长因子+0.1nmol/L地塞米松)中进行诱导分化,3天换液1次,连续诱导14天。在第0、7、14天用显微镜记录细胞形态。2.3.2定量PCR检测基因表达按照RNA提取试剂盒方法(Trizol+氯仿+异丙醇提取法)从培养至第0、7、14天组大鼠CD90+Lin-骨髓间充质干细胞中提取总RNA。把1μg的总RNA作为模板,逆转录反应体系依照荧光定量PCR试剂说明书所配制,合成cDNA的第一链,然后在PCR仪内进行PCR扩增实验。最后的PCR结果依照相对定量法计算。2.3.3 Klf4和Nanog启动子区甲基化检测按照细胞基因组DNA提取试剂盒说明书,从第0、7、14天组大鼠CD90+Lin-骨髓间充质干细胞中提取基因组DNA,根据甲基化转化试剂盒说明书进行DNA重亚硫酸盐转化。完成后于PCR仪内进行甲基化PCR反应。最后提取甲基化PCR反应产物进行琼脂凝胶电泳进行产物分析。2.3.4统计学分析应用SPSS 20.0统计分析软件来进行计算,计量资料以(?)x±s表示。Alb、Nanog mRNA和Klf4 mRNA表达量采用单因素方差分析,而他们的组间差异两两互相比较则运用LSD检验方法;基因启动子区甲基化频率采用χ2检验,P<0.05视为具有统计学差异。3.结果大鼠CD90+Lin-骨髓细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中的第0、7、14天,Alb mRNA相对表达量显著随时间增长而增加(p=0.001)。第0天至第7天,Klf4和Nanog的表达显著减少(p<0.001),Klf4启动子区第1、2个CpG位点甲基化频率显著上升(p<0.001),第3个CpG位点甲基化频率无显著性变化(p=0.247);Nanog启动子区第1个CpG位点甲基化频率显著下降(p<0.001),第2个CpG位点甲基化频率显著上升(p<0.001)。第7天至第14天,Klf4(p<0.001)和Nanog(p=0.045)的表达显著增加,Klf4第1个CpG位点甲基化频率显著上升(p=0.007),第2、3个CpG位点甲基化频率显著下降(p<0.001);Nanog第1个CpG位点甲基化频率无显著变化(p=0.109),第2个CpG位点甲基化频率显著下降(p<0.001)。4.结论CD90+Lin-骨髓间充质干细胞在体外诱导向肝细胞分化过程中,Klf4和Nanog基因启动子区CpG位点的甲基化变化不仅会影响Klf4和Nanog的表达,还可能会影响到其它与分化有关基因的表达,这意味着它们在体外诱导分化过程中很可能起重要的调控作用。