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本文是吉林省科技厅自然科学基金项目“基于NF-κB炎症相关信号通路的淫羊藿总黄酮及淫羊藿苷抗动脉粥样硬化机制研究”(编号:20150101221JC)、吉林省教育厅“十三五”科学技术项目“淫羊藿苷干预NF-κB信号传导通路抗动脉粥样硬化的实验研究”(吉教科合字[2016]第247号)阶段性研究成果。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是危害人类健康的常见疾病,是心脑血管疾病的主要病理学基础。近年来,随着人们生活方式及饮食习惯的改变,由AS所致的冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的发生率和死亡率呈逐年上升趋势。因此,控制AS的发生发展是治疗心血管系统疾病的关键环节,对降低心血管系统疾病的致死风险具有重要意义。淫羊藿苷(icariin,ICA)是中药淫羊藿的主要活性成分,具有抗骨质疏松、抗炎、抗肿瘤和免疫调节等药理作用,随着对淫羊藿苷研究的不断深入,其对心血管系统疾病的防治作用已成为研究热点。但有关淫羊藿苷抗AS作用及相关机制的研究较少,且研究不够深入。本研究应用形态学、生物化学、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、流式细胞术、Western blotting、Real time-PCR等实验技术,通过体内(动物)和体外(细胞)实验,以MAPK信号通路为切入点,系统地研究淫羊藿苷抗AS的作用及分子机制,以期为临床应用淫羊藿苷治疗AS提供理论依据。在体内实验中,沿用本实验室改良的大鼠AS模型复制方法,即采用腹腔注射VD3(70万U/kg)联合高脂饲料喂养,成功诱导大鼠AS模型。灌胃给予淫羊藿苷4w后,检测大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、ox-LDL等脂质代谢指标水平,血清SOD、MDA等氧化应激指标活性或含量,血清TNF-α、IL-6等炎症因子水平,以及胸主动脉组织ICAM-1,VCAM-1及E-selectin等黏附分子和PCNA基因及蛋白的表达,并检测了胸主动脉组织ERK1/2、p38、JNK等蛋白磷酸化水平。实验结果表明,与正常对照组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL水平显著升高,HDL-C水平显著降低,血清SOD活性显著下降,MDA含量显著增加,血清TNF-α、IL-6及胸主动脉组织ICAM-1,VCAM-1、E-selectin基因表达水平显著升高,胸主动脉组织PCNA蛋白表达水平显著增加,p38、ERK1/2及JNK蛋白磷酸化水平显著升高。与模型对照组比较,淫羊藿苷高、低剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C、ox-LDL等脂质代谢指标水平均显著降低,HDL-C水平显著升高,SOD活性显著升高、MDA含量显著下降,TNF-α、IL-6水平均显著下降,胸主动脉组织ICAM-1,VCAM-1、E-selectin、PCNA等指标基因或蛋白表达量显著降低,ERK1/2、p38、JNK等蛋白磷酸化水平显著降低。以上结果表明,淫羊藿苷具有显著的抗大鼠AS作用。在体外实验中,为确定淫羊藿苷抗AS作用机制是否与抑制血管平滑肌细胞增殖作用有关,我们采用ox-LDL(50μg/ml)诱导的VSMCs增殖模型,应用Western blotting及流式细胞术分别检测VSMCs中PCNA蛋白表达及细胞周期时相,研究淫羊藿苷对ox-LDL诱导VSMCs增殖的影响。实验结果显示,淫羊藿苷可以显著降低ox-LDL诱导的VSMCs存活率,减少PCNA合成,降低S期、G2/M期细胞百分率,出现明显的G0/G1期阻滞。进而表明,淫羊藿苷可以抑制ox-LDL诱导的VSMCs增殖。为确定淫羊藿苷抗AS作用机制是否与保护血管内皮作用有关,我们以ox-LDL(100μg/ml)诱导血管内皮细胞损伤,探讨了淫羊藿苷对受损血管内皮细胞的保护作用。MTT实验结果显示,淫羊藿苷可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤,显著提升受损细胞存活率;流式细胞术检测结果显示,淫羊藿苷可以降低ox-LDL诱导的HUVECs早期凋亡率。进而表明,淫羊藿苷可以抑制ox-LDL诱导的HUVECs损伤及凋亡。为阐明淫羊藿苷对ox-LDL诱导HUVECs损伤和凋亡的作用机制,本研究采用ELISA、免疫荧光染色、Real-time PCR、Western blotting等方法及技术,对相关指标进行了检测。结果显示,淫羊藿苷可降低受损血管内皮细胞炎症因子(TNF-α、IL-6)水平,抑制黏附分子(ICAM-1,VCAM-1,E-selectin)基因表达,升高SOD活性,降低MDA含量,从而抑制HUVECs由ox-LDL引起的炎症反应及氧化应激损伤;淫羊藿苷尚可上调Bcl-2蛋白、下调Caspase-3蛋白表达,抑制ox-LDL诱导的HUVECs NF-κB p65核转移。为确定淫羊藿苷抑制ox-LDL诱导的VSMCs增殖及HUVECs损伤作用是否与MAPK信号通路相关,本研究探讨了淫羊藿苷对ox-LDL诱导增殖的VSMCs及损伤的HUVECs中ERK1/2、p38、JNK蛋白磷酸化的影响。研究结果显示,淫羊藿苷仅可显著抑制ox-LDL诱导的VSMCs中ERK1/2、p38蛋白磷酸化,对JNK磷酸化无影响;并仅可显著抑制ox-LDL诱导的HUVECs中p38、JNK蛋白磷酸化,对ERK1/2磷酸化无影响。进而表明,MAPK信号通路介导ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖及血管内皮细胞损伤过程,而淫羊藿苷可能通过抑制ERK1/2、p38MAPK信号通路激活,抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖,并可能通过抑制JNK、p38 MAPK信号通路激活,抑制ox-LDL诱导的血管内皮细胞的损伤。综上所述,淫羊藿苷可调节动脉粥样硬化大鼠的血脂水平,减少ox-LDL生成量,抑制高脂饲料诱导的大鼠动脉粥样硬化。其抗动脉粥样硬化的机制可能与阻断ERK1/2、p38 MAPK信号通路激活而抑制血管平滑肌细胞增殖有关,亦可能与阻断JNK、p38 MAPK及NF-κB信号通路激活而抑制血管内皮细胞损伤及凋亡有关。