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鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu Virus,DTMUV）引起的一种急性传染病,给养殖业的健康发展带来了严峻考验。灭活疫苗因其安全性高被广泛应用,但在免疫保护期和有效性方面存在缺陷。未甲基化寡聚脱氧核苷酸（Cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotide,CpG ODN）因其良好的免疫刺激作用成为目前被广泛研究的一种新型佐剂。截至目前,已初步探讨了CpG ODN作为佐剂对水禽的免疫刺激作用,并取得了较为理想的结果,但人工合成CpG ODN的成本较高无法规模化生产和应用。于pUC18载体中插入CpG基序的实验思路已被一些研究团队证实是可行的,同样能够增强疫苗的免疫效果。本研究首先设计合成18条CpG ODNs,分别通过鸭外周血淋巴细胞增殖实验和实时荧光定量PCR测定CpG ODNs作用后的刺激指数和相关免疫基因的mRNA表达水平,从而确定最优的CpG ODN,随后构建含有10个该最优序列拷贝的pUC18-CpG重组质粒并进行两者免疫活性的比较。结果显示,通过细胞增殖实验初筛发现刺激指数较高的三种CpG ODN分别为B-2、C-3和P-4;实时荧光定量PCR检测发现,在P-4刺激的细胞中,IL-2和IFN-α（p<0.001）、IL-6和IL-10（p<0.01）以及TLR21（p<0.05）mRNA表达水平最高;pUC18-CpG的刺激指数略低于P-4序列,且各细胞因子的mRNA表达也略低于P-4序列,但差异均不显著（p>0.05）。以上结果表明,pUC18-CpG可替代人工合成的P-4序列进行疫苗制备。以灭活DTMUV-HB为抗原,pUC18-CpG为佐剂,在实验室制备了共13批疫苗,其中A、B疫苗组分别为DTMUV+CpG、1/2 DTMUV+CpG,E、G疫苗组分别为DTMUV、1/2 DTMUV。经稳定性、安全性、无菌性检验合格后进行动物评价实验。通过HI实验和间接ELISA检测各组抗体效价水平及细胞因子的蛋白水平,通过RT-PCR确定攻毒后的病毒分离结果。结果显示,在1/4剂量下,实验组之间的HI抗体滴度差异不显著（p>0.05）;当1/2剂量和全剂量免疫时,A、B两组的HI抗体滴度显著高于E、G两组。抗体阳性率和GMT值变化趋势与HI抗体水平一致。经检测发现,与未添加佐剂的实验组相比,全剂量免疫的北京鸭血清中A1组与B1组的4种蛋白中有3种呈上调表达。尤其是在14 dpi时,A1组IFN-γ和IL-6的蛋白表达显著高于E1组（p<0.01）,B1组IFN-γ的蛋白表达显著高于G1组（p<0.05）。此外,在24 dpi和35 dpi时,A1组IL-2的表达水平显著高于E1组（p<0.01;p<0.05）。A、B两组的全剂量和1/2剂量组能100%抵抗病毒攻击。此外,A组和B组的PD50值分别为4和4.5,高于E组和G组的1.4和1.8。因此,CpG佐剂可以有效增强DTMUV-HB灭活疫苗的免疫作用,既能增强体液免疫应答,促进早期抗体产生,提高抗体效价,延长免疫持续期;又能增强细胞免疫应答,诱导产生高水平的细胞因子;同时可将攻毒保护率提高至100%。在所有疫苗实验组中,以全剂量的1/2DTMUV+pUC18-CpG的疫苗组最为经济高效。