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第一部分Nox4在草酸钙结石患者肾乳头中的表达及其机制的初步探究【目的】探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶亚单位4（Nox4）在草酸钙结石患者肾乳头中的表达及其潜在的作用机制。【方法】通过GEO数据库检索Randall钙斑芯片,按照GSE73680的样本描述,将样本分为无结石对照组（6例）和草酸钙结石组（24例）。采用GEO2R分析正常人肾乳头和草酸钙结石患者肾乳头组织中Nox4及成骨相关蛋白基因的表达差异变化。采用1,25（OH）2D3构建高钙尿结石大鼠模型,采用高钙（1.0mg/ml）处理大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）24h,免疫荧光技术（IF）检测Nox4的表达,蛋白质印迹法检测Nox4、Nox2、p22、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、骨形态发生蛋白2（BMP2）和骨桥蛋白（OPN）的表达,化学发光法测定氧化应激标记物丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。【结果】GEO2R分析结果显示Nox4、OPN、骨钙素（OCN）和骨保护素（OPG）在草酸钙结石组表达升高,基质Gla蛋白（MGP）在草酸钙结石组表达下降。免疫荧光结果显示高钙处理的NRK-52E细胞中Nox4的平均荧光吸光度明显高于对照组。蛋白质印迹法显示相对于未处理的正常对照组,高钙处理的NRK-52E细胞中Nox4、p22、MAPK、BMP2和OPN表达明显增加,Nox2表达无明显改变。与对照组大鼠相比,高钙尿结石模型大鼠肾脏中p22蛋白表达增加,Nox2蛋白表达无明显变化。此外,高钙处理NRK-52E细胞后,MDA含量增加,SOD活性下降。【结论】Nox4基因在草酸钙结石患者肾乳头组织的表达明显升高。肾小管上皮细胞氧化应激和MAPK信号通路的激活以及成骨样转化很可能是Nox4调节草酸钙结石形成的具体作用机制。第二部分高钙激活Nox4/ROS介导的氧化应激对肾小管上皮细胞损伤和凋亡的作用研究【目的】探讨高钙激活Nox4/ROS介导的氧化应激对肾小管上皮细胞损伤和凋亡的作用及其潜在机制。【方法】采用1,25（OH）2D3构建高钙尿结石大鼠模型,通过肾包膜下注射腺相关病毒2（AAV2）来阻断肾脏的Nox4表达,通过选择性Nox1/4抑制剂GKT137831来抑制肾脏Nox4活性。采用高钙（1.0mg/ml,24h）处理NRK-52E,通过CRISPR/Cas9技术沉默细胞内Nox4表达,用慢病毒转染技术上调Nox4表达。PKC抑制剂GF109203X用于抑制NRK-52E细胞内PKC的活性。CCK-8检测高钙对细胞活力的影响。收集大鼠24h尿量并测定尿钙浓度。流式细胞术检测NRK-52E细胞内钙离子和活性氧（ROS）水平以及细胞凋亡情况。Western blot检测细胞和肾脏中p-PKC/PKC、Nox4以及Keap1/Nrf2的表达。苏木精-伊红（HE）染色检测大鼠肾脏组织学形态。TUNEL检测大鼠肾脏中细胞凋亡情况。透射电镜（TEM）观察高钙处理下NRK-52E细胞的形态变化。DHE荧光探针显示肾组织中ROS生成情况。化学发光法测定细胞和肾脏中内氧化还原物质（SOD、CAT、MDA和8-OHd G）的活性和含量。【结果】高钙处理后NRK-52E细胞活力显著降低,且呈浓度/时间依赖性。1,25（OH）2D3诱导的SD大鼠24h尿钙水平和尿钙浓度均显著高于对照组,而24小时尿量没有显著变化。高钙处理下NRK-52E细胞内Ca2+水平升高,且不受Nox4表达调节的影响。高钙可激活NRK-52E细胞中p-PKC和Nox4的表达,而PKC抑制剂能抑制Nox4的表达,提示高钙可能通过PKC来激活Nox4的表达。此外,高钙可增加肾脏和细胞中ROS/H2O2的产生,调节Nox4的表达和活性可改变这种现象。高钙调控的肾脏和细胞氧化应激水平依赖于Nox4的表达。高钙尿大鼠肾脏损伤和凋亡明显增加,而抑制Nox4的表达或活性可明显改善这些损害。同样高钙处理下NRK-52E细胞会发生损伤和凋亡,而调节Nox4的表达会加重或减轻上述变化。高钙诱导NRK-52细胞和大鼠肾脏内Keap1蛋白表达增加,Nrf2蛋白表达下降。【结论】一方面高钙通过PKC激活肾小管上皮细胞内Nox4的表达,Nox4衍生的ROS/H2O2可导致氧化应激的发生;另一方面高钙诱导细胞内Keap1/Nrf2通路的改变,抑制了抗氧化酶的表达。肾小管上皮细胞内氧化还原稳态的失调介导细胞的损伤和凋亡,进而导致草酸钙结石的形成。第三部分高钙激活Nox4/MAPK通路介导的肾小管上皮细胞成骨样转化在Randall钙斑和草酸钙结石形成中的作用研究【目的】探讨高钙激活Nox4/MAPK通路介导的肾小管上皮细胞成骨样转化在Randall钙斑和草酸钙结石形成中的作用。【方法】采用1,25（OH）2D3构建高钙尿结石大鼠模型,通过肾包膜下注射腺相关病毒2（AAV2）来阻断肾脏的Nox4表达,通过Nox1/4抑制剂GKT137831来抑制肾脏Nox4活性。采用高钙（1.0mg/ml,24h）处理NRK-52E,通过CRISPR/Cas9技术沉默细胞内Nox4表达,用慢病毒转染技术上调Nox4表达。p38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂PD98059分别用来抑制NRK-52E内MAPK（p38/JNK/ERK）的活性。采用Von Kossa染色和茜素红染色检测大鼠肾脏和NRK-52E细胞的钙盐沉积情况。免疫荧光技术检测NRK52E细胞中Nox4的表达。Western blot检测大鼠肾脏和NRK-52E细胞中Nox4、P38/p-P38、ERK/p-ERK、JNK/p-JNK、BMP2和OPN的表达。免疫组化染色检测大鼠肾脏组织内Nox4、BMP2和OPN表达。实时定量PCR检测细胞中Nox4、BMP2和OPN m RNA的表达情况。【结果】高钙可诱导大鼠肾脏和NRK-52E细胞的钙盐沉积,抑制Nox4表达或活性时,钙盐沉积现象明显减弱,上调Nox4表达时,钙盐沉积则显著增加。高钙激活大鼠肾脏和NRK-52E细胞中的Nox4和MAPK信号通路蛋白的表达,抑制Nox4表达或活性明显减弱了高钙诱导的MAPK磷酸化蛋白表达,而上调Nox4表达显著增强了高钙诱导的MAPK磷酸化蛋白表达。此外,Nox4参与调控高钙诱导下肾小管上皮细胞中成骨相关蛋白BMP2和OPN的表达。ERK和JNK抑制剂会显著降低高钙诱导的NRK-52E细胞中BMP2和OPN表达,提示高钙通过激活Nox4/MAPK通路来介导NRK-52E细胞中成骨相关蛋白的表达。此外,MAPK抑制剂能显著减弱高钙诱导的NRK-52E细胞中Nox4的增加,这表明在高钙暴露的NRK-52E细胞中,MAPK可通过正反馈回路调控Nox4的表达。【结论】高钙诱导的Nox4通过ERK/JNK MAPK信号通路介导成骨相关蛋白BMP2和OPN的异常激活,诱导肾小管上皮细胞转分化为成骨样细胞,导致Randall钙斑和草酸钙结石的形成。