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松材线虫，学名Bursaphelenchus xylophilus (Steiner&Buhrer)，异名Bursaphelenchus lignicolus (Mamiya Y&Kiyohara)是一种重要的检疫性外来入侵物种，通过松墨天牛进行传播，是松属树种的毁灭性病害，给亚洲多个国家和地区造成巨大的经济损失。松材线虫的生活史分为繁殖阶段和扩散阶段，在特定条件下这两个阶段可以相互转换。这种特性有利于松材线虫在不良环境条件下保持较高的存活率，也有利于松材线虫随天牛传播扩散，但这种转换机制尚不明确。为了明确松材线虫繁殖型和扩散型转换的机制，本研究根据模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhadits elegans)的滞育机制，以模式线虫滞育相关基因为基础，从松材线虫中克隆相关基因daf-3、daf-9、daf-12和daf-16，并分析基因在不同虫态和环境条件下的表达模式，并利用农杆菌介导灰葡萄孢菌表达松材线虫基因dsRNA的技术，敲低松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16-1、daf-16-2基因的表达，并对其发育、繁殖量、寿命、脂肪积累等性状进行了统计，初步确定基因对松材线虫滞育的影响和作用，同时建立原生质体转化体系，成功敲除灰葡萄孢菌的Dicer-1基因，为以喂饲法介导RNA干扰研究松材线虫功能奠定基础。主要研究结果如下：1.采用RACE法从松材线虫中克隆与秀丽隐杆线虫滞育调控基因同源的daf-3、daf-9、daf-12和daf-16基因（daf-9、daf-12和daf-16基因登录号分别为GU256938、GU584879、JN628938、GU584878）。其中daf-3基因由9个外显子和8个内含子组成，属于MH蛋白家族；daf-9基因由6个外显子和5个内含子组成，属于细胞色素P450蛋白家族；daf-12基因含有6个外显子和5个内含子，属于核激素受体（NHR）蛋白家族；daf-16属于FOXO转录因子家族，存在2个基因即daf-16-1和daf-16-2，每个基因有2种剪接方式。在松材线虫基因组中daf-3、daf-9、daf-12和daf-16均为单拷贝基因。蛋白序列比对分析表明，松材线虫daf-3、daf-9、daf-12和daf-16基因分别与其同族基因具有高度保守性。2.分析了松材线虫繁殖型和扩散型中daf-9和daf-12基因的表达模式。Daf-9和daf-12在松材线虫不同发育时期和不同虫态中均有表达，但是在扩散型和繁殖型线虫中表达量变化较大。基因daf-9在扩散型Ⅲ龄线虫中表达水平极低，仅为繁殖型幼虫的1/10，而在扩散型Ⅳ龄幼虫中的表达量则与繁殖型幼虫持平。基因daf-12在扩散型Ⅲ龄线虫中表达水平与繁殖型幼虫基本持平，而在扩散型Ⅳ龄幼虫中表达量为扩散型Ⅲ龄的20倍以上，说明在松材线虫由繁殖型进入扩散型时daf-9基因大幅度下调，导致daf-12（NHR）缺少配体，而使松材线虫进入并保持扩散型Ⅲ龄。松材线虫此时出现积累脂肪，停止发育等表型，进入扩散型Ⅳ龄后，松材线虫daf-9基因恢复至繁殖型幼虫水平，daf-12基因大幅上调，daf-9利用松材线虫体内的固醇类物质合成DA，为daf-12提供配体。松材线虫由扩散型Ⅲ龄进入扩散型Ⅳ龄后，固醇类物质消耗掉而得不到补充，DA的合成再次被降低，使松材线虫维持扩散型Ⅳ龄幼虫。3.分析了松材线虫daf-3、daf-9、daf-12和daf-16基因在松材线虫应对外界不良条件（食物缺乏、高温、低温、种群密度增大）的表达模式。在温度适宜、食物充足、种群密度不大的条件下，松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16基因均上调表达；在食物匮乏的情况下，松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16基因均呈下调表达；当种群密度过大时，daf-3、daf-9、daf-12、daf-16基因均上调表达；低温时，daf-3、daf-12、daf-16-1基因呈上调表达，daf-9、daf-16-2基因呈下调表达；高温胁迫下，除daf-16-1基因略下调外，其它基因均上调表达。Daf-16-2蛋白在食物匮乏和低温胁迫下，大幅下调表达，而高温胁迫对其影响不大。4.构建了农杆菌介导转化在丝状真菌中表达dsRNA的载体PHD-RH，并利用灰葡萄孢菌介导表达松材线虫daf-3、daf-9、daf-12、daf-16-1、daf-16-2以及非靶性的sGFP基因的dsRNA，分别这些菌株连续培养松材线虫10代后（以转空载体的菌株为对照），分析松材线虫靶标基因表达量、发育速度、繁殖量、寿命、脂肪积累等表型。经过连续10代的RNAi处理松材线虫的靶标基因表达量下调近20倍，而sGFP基因dsRNA对靶标基因的表达没有影响；经daf-9、daf-12、daf-16-2基因RNAi处理后松材线虫发育速度显著低于对照（空载体），而经其它基因RNAi处理的线虫对其发育速度无影响；daf-9、daf-12基因RNAi处理的线虫繁殖量显著减少，而daf-16-1和daf-16-2RNAi处理的线虫繁殖量显著增加，经daf-3和sGFP基因RNAi处理的线虫对其繁殖量无影响；经daf-9、daf-12、daf16-1基因RNAi处理的线虫寿命显著增高，经daf-3、daf16-3、sGFP基因RNAi处理的线虫对其寿命无影响；经daf-3、daf-9、daf-12、daf16-1、daf-16-2基因RNAi处理的线虫脂肪含量均显著高于对照，而sGFP基因RNAi对松材线虫的脂肪积累量没有影响。5.建立灰葡萄孢菌原生质体转化体系，对灰葡萄孢菌Dicer-1基因进行同源敲除，获得了Dicer-1基因功能缺失的灰葡萄孢菌突变体，为更近一步利用灰葡萄孢菌表达松材线虫基因dsRNA研究松材线虫基因功能奠定了基础。