海藻养殖是我国海水养殖产业的重要组成部分,2018年我国海藻养殖总产量达到235万吨,占全年养殖产品总量的8.72%。藻类养殖业的快速发展带来可观的经济效益的同时,藻类病害问题逐渐发展成为制约我国藻类养殖业健康发展的重要瓶颈。相较于水产养殖动物而言,关于海水养殖藻类病害的研究尚处于起步积累阶段。本研究以条斑紫菜(Porphyra yezoensis)丝状体“黄斑症”和掌状海带(Laminaria digitata)“绿烂症”为研究对象,通过病原学、病理学、感染微生态学等技术方法,系统解析条斑紫菜和掌状海带细菌性疾病的病原病理特性,并深入解析病原侵染对藻类表面菌群结构的影响。相关研究结果将进一步提升我国海水养殖藻类疾病的研究基础,并为开发藻类病害防控技术以及保障我国藻类健康养殖提供理论支撑。相关研究结果如下:1、条斑紫菜丝状体“黄斑症”的病原学研究本研究以采集自山东省岚山市患有“黄斑症”的条斑紫菜丝状体为研究对象,流行病学调查显示,条斑紫菜丝状体“黄斑症”发病速度快,扩散面积广,传染率约90%。其临床症状主要表现为:丝状体附着物病灶处呈现大小不一的黄色斑点,随着感染加重,黄褐斑颜色逐步加深,最终出现由藻体死亡导致的溃烂症状。采集具有典型黄斑症状的条斑紫菜丝状体,通过病原分离和体外培养技术,筛选获得优势菌株PZ02。通过革兰氏染色、电镜负染观察、生理生化分析、药物敏感性分析以及16S r DNA鉴定等技术方法对菌株进行鉴定分析,并结合回归感染实验确认菌株PZ02的致病能力,结果表明:(1)菌株PZ02属革兰氏阴性菌,短杆状,大小(0.5～1.0)um×(1.5～5.0)um,具有端生鞭毛。依据16S r DNA构建的系统发育树表明,该株菌与假单胞菌属聚为一支,且与浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)相似度最高,为100%。(2)生理生化和药敏检测结果显示,该菌株可无盐、6%Na Cl和10%Na Cl胰胨水中均可生长,氧化酶、3%Na Cl ONPG、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶中结果反应均呈阳性,能代谢利用葡萄糖,不能利用鼠李糖、蜜二糖、蔗糖、乳糖、山梨醇、甘露醇、肌醇、苦杏仁苷,其生理生化特性与浅黄假单胞菌生理生化特性相一致;药敏试验结果显示,PZ02菌株对:罗美沙星、氟罗沙星、氯霉素、青霉素、庆大霉素、阿奇霉素、卡那霉素、氟哌酸、头孢他啶十种药物呈现高度敏感,对利福平、红霉素、吡哌酸、萘啶酸、四环素、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定、恩诺沙星、氟苯尼考、阿奇霉素、新生霉素、多粘菌素、氨苄青霉素、苯唑青霉素呈现抗性。(3)回接感染试验表明,用浓度10~6～10~8 CFU/m L的PZ02菌液浸泡健康条斑紫菜丝状体13d后,10~8 CFU/m L实验组的藻体出现大小不一的黄色斑点,与自然发病的黄斑症典型症状一致,10~6 CFU/m L和10~7 CFU/m L实验组内的丝状体患病症状不明显;对患病部位进行再次分离鉴定表明,人工感染患病的条斑紫菜丝状体内分离得到了相同的优势分离株,进一步表明浅黄假单胞菌PZ02是引发条斑紫菜丝状体黄斑症的致病原。2、养殖掌状海带“绿烂症”的病原学和组织病理学研究本研究对山东省荣成市某养殖厂内患有“绿烂症”的掌状海带进行病原学和组织病理学分析。该疾病的主要发病症状为:患病掌状海带藻体病灶部位由棕褐色变浅褐色,随着病情进一步加深,叶片腐烂面积逐步扩大,严重感染的叶片处色素体解体呈现透明发黄发白现象。通过病原分离和体外培养技术,自患病掌状海带病灶处分离得到一株优势细菌LD01。通过革兰氏染色、电镜负染观察、回归感染试验、生理生化检测、药物敏感性分析、16S r DNA测序分析等技术方法对其进行鉴定分析。并采用石蜡切片、超微病理和叶绿素荧光光谱检测技术对患病掌状海带的病理学进行分析,结果如下:(1)16S r DNA测序分析表明,LD01与溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)相似度最高,为99.34%。采用浓度为10~4～10~8 CFU/m L的LD01菌液浸泡感染健康掌状海带藻体,10~8 CFU/m L实验组均出现典型的绿烂症病症,且与自然发病典型症状一致;浓度小于10~8 CFU/m L的实验组内患病症状不明显。结果初步表明溶藻弧菌LD01为掌状海带“绿烂症”的致病原。(2)菌株LD01的生理生化结果显示其在3%、6%、10%三种不同百分比的胰胨水中均生长,氧化酶反应阳性,在鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶中反应呈阳性,能利用蔗糖、甘露醇,在无盐胰胨水中不生长,在精氨酸双水解酶、3%Na Cl MR-VP、3%Na Cl ONPG反应呈阴性,不能利用葡萄糖、阿拉伯糖、乳糖、肌醇、苦杏仁苷、肌醇、鼠李糖、蜜二糖。同时,药物敏感性实验结果分析显示,LD01该菌株氧氟沙星、氟罗沙星、萘啶酸、四环素、强力霉素、氟苯尼考、菌必治、阿奇霉素、阿米卡星、头孢他啶、头孢噻肟药物高度敏感,对环丙沙星、乙酰螺旋霉素、多粘菌素、新霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素、青霉素、苯唑青霉素、复方新诺明、头孢氨苄、头孢拉定、吡哌酸不敏感。(3)经石蜡切片和超微病理学观察发现,掌状海带在感染溶藻弧菌后,随着浸染时间的加长,藻体内皮层细胞细胞壁破裂严重,其次为外层和髓部;扫描电镜下观察发现藻体细胞壁表面附着大量细菌,呈粘液团状,随着侵染时间的推移,细胞壁破裂,胞内结构破裂;透射电镜观察结果显示叶绿体是掌状海带发病损伤最为严重的细胞器,随感染时间的加长,叶绿体出现裂解,其次是细胞核,随感染时间推移,核膜核仁出现溶解。(4)叶绿素荧光光谱检测研究发现,与对照组相比,感染组掌状海带的光系统Ⅱ最大荧光产量(Fv/Fm)、光系统Ⅱ反应中心的潜在活性(Fv/F0)均随菌液感染浓度的升高而降低,表明掌状海带感染发病后叶片光系统供体侧以及反应中心的活性均受到病原菌的影响。3、掌状海带“绿烂症”菌群群落结构特征分析通过Hiseq2500 PE250测序平台对患有“绿烂症”的掌状海带进行海带叶片表面菌群群落结构进行分析,结果如下:本次测序获得掌状海带表面细菌样品优化序列91784条,可归790个OTUs,隶属于10个门,9个属。在门水平上,健康海带组首要优势菌门是蓝藻菌门Cyanobacteria(>90%);患病海带组出现了两大优势菌门,首要优势菌门是变形菌门Proteobacteria(>50%),其次为蓝藻菌门Cyanobacteria(>46%)、拟杆菌门Bactemidetes(>1%)、浮霉菌门Planctomycetes(>1%)等;属水平上,健康海带组首要优势菌属是嗜冷单胞菌属Psychromonas(>1%)和Blastopirellula菌属(>1%),并且健康海带组中存在无法检测序列的不知名物种的相对丰度超过90%以上;患病海带组首要优势菌属是弧菌属Vibrio(>30%),次要优势菌门为嗜冷单胞菌属Psychromonas(>2%),假交替单胞菌属Pseudoulteromonas(>1%)、海单胞菌属Marionmonas(>1%)、亚硫酸杆菌属Sulfitobacter(>1%)。结合以上结果分析得知健康组海带样本与患病组海带样本细菌群落组成相似,但各菌群丰度存在较大差异;此外,患病海带组出现的首要优势菌属为弧菌属(Vibrio),结果进一步佐证了弧菌是导致此次掌状海带“绿烂症”的重要致病原。