枇杷细胞悬浮培养体系的建立及优化

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论文以不同品种枇杷为试验材料,以诱导的愈伤组织状态以及愈伤含有的Ursolic Acid(UA)及Oleanic acid(OA)含量为指标,选择适宜枇杷细胞悬浮培养的品种、外植体以及适宜的激素配比,建立良好的愈伤组织诱导与继代体系。将该愈伤组织转入液体进行振荡培养,初步建立枇杷细胞悬浮培养系,并在此基础上优化,建立适宜枇杷细胞生长及UA、OA含量积累的培养体系。主要结果如下:1枇杷优良愈伤组织的获得及继代培养试验从枇杷品种、外植体部位、激素配比、显微观察方面研究,获得枇杷悬浮培养适宜的愈伤,结果表明:最适宜枇杷细胞悬浮培养及UA、OA含量积累的枇杷品种为早钟6号,虽然含有的UA、OA含量较低(6.898、2.343mg/g.DW),但其诱导率高(83.697%)、愈伤组织嫩黄、疏松、颗粒明显,为最适枇杷品种。最适外植体为幼胚,花丝诱导率虽高(接近100%),但质地坚硬;叶片及茎尖的诱导率低;而幼胚诱导的愈伤组织,诱导率(83.17%)较高。同时幼胚诱导的愈伤组织的UA及OA(5.099、1.617mg/g.DW)显著高于花丝、叶片、茎尖,为最佳外植体。最合适的幼胚诱导培养基为MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT,继代培养基为MS+0.5mg/L2,4-D+0.25mg/LKT。显微观察也表明幼胚诱导的愈伤组织最适用于枇杷悬浮培养。同时,试验鉴于花丝诱导的优越性,对花丝愈伤组织进行调控,调控两代后出现细软、嫩黄的愈伤组织,但继代两三次后愈伤组织转白,水渍化,状态不佳,有待进一步研究。2枇杷细胞悬浮培养体系建立在枇杷细胞的液体培养中,细胞生长呈现典型的“S”曲线,培养周期为18d。以细胞FW增长倍数及UA、OA的增长倍数为衡量指标,对悬浮培养体系进行优化。结果表明:悬浮培养最适培养基配方为:MS+NAA0.5mg/L,枇杷细胞鲜重25.863g.FW,为初始3.577倍,UA及OA含量分别为36.490、6.975mg/g.DW,为初始4.744倍、2.881倍。最适接种量80g/L,pH6.0,碳源浓度30g/L,温度25℃,光照400Lux,转速130r/min,装液量130mL/250mL。对最适激素的考察可知,生长素NAA>2,4-D>IBA,细胞分裂素KT>BA,且生长素、细胞分裂素的单独作用效果好于组合作用,及NAA>KT>NAA、KT。同时,试验研究了诱导子对枇杷细胞生长及UA、OA含量的影响,结果表明100mg/LMJ的加入为试验中最适宜的诱导子,鲜重34.65g.FW,UA及OA含量33.089、6.496mg/g.DW,分别为对照CK的1.080、2.540、2.590倍。综上,试验建立了适宜的枇杷细胞悬浮培养体系。3UA及OA含量的提取与测定试验在枇杷叶UA及OA超声提取方法的基础上改良,以95%乙醇为溶剂,对UA、OA的超声提取方法进行优化,得到最适的提取方法为:超声功率50W、超声时间25min、料液比1:40、超声次数2次。在此方法下,测得枇杷细胞内UA及OA的超声提取率分别达99.3%、98.4%。同时,试验结果还表明:建立的HPLC法稳定性好、精确度高,UA、OA的分离度较好,适用于枇杷细胞的UA、OA含量测定。综上所述,试验建立了良好的愈伤组织诱导和继代方法,获得了适宜枇杷悬浮培养的疏松、嫩黄、颗粒状明显的愈伤;在初步建立枇杷悬浮培养体系的基础上,优化悬浮培养条件,建立了适宜枇杷细胞生长及UA、OA含量积累的培养体系。
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