背景:免疫稳态是机体免疫系统与外界、免疫系统内部各组分之间相互作用而形成和维持的平衡状态,是维持机体生命健康的关键因素,感染性疾病、自身免疫病和肿瘤等疾病的发生发展均与免疫稳态失衡密切相关。近年来,微环境改变、免疫稳态失衡与疾病发生发展三者之间的关系受到人们的重视,已经成为生命科学领域的重点关注方向。巨噬细胞是重要的天然免疫细胞和抗原递呈细胞,极化状态是其参与免疫稳态和微环境调控的重要机制。巨噬细胞至少有两种不同的极化状态,即主导“促炎和杀伤”功能的M1型极化和主导“抑炎和修复”功能的M2型极化?越来越多的研究显示,巨噬细胞的极化失衡是多种免疫相关疾病如自身免疫病、肿瘤等疾病的关键病理因素。巨噬细胞极化调控靶分子的探索研究成为新的研究热点。虽然已知Stat1、Stat3、Stat6、SOCS1、IRF4和IRF5等信号分子,以及多种mi RNA等均参与了巨噬细胞的极化调控,但在不同的微环境下不同的受体分子如何激活上述极化调控信号尚不十分清楚。寻找新型巨噬细胞调控分子,明确其调控机制,对于实现靶向巨噬细胞的免疫干预具有重要的理论及现实意义。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(T-cell Ig-mucin-3,Tim-3)是2002年鉴定出的新型免疫调控蛋白,主要表达在活化的Th1、Th17和Tc1细胞上。Tim-3与其配体半乳凝素-9(Galectin-9,Gal-9)结合后能通过诱导凋亡等机制抑制上述T细胞的功能,维持体内免疫耐受,被认为是新一代的免疫调控靶点。随着研究的不断深入,我们课题组及其他课题组发现Tim-3也表达在天然免疫细胞上。我们的前期研究发现Tim-3在脓毒血症中的表达或功能异常与体内巨噬细胞的过度活化有关,提示Tim-3对巨噬细胞的负性调控作用,表明该分子可能是巨噬细胞新的调控靶点。在结构上Tim-3胞内段较短,不存在像其他负性免疫调控分子如PD-1一样的抑制性基序,因此目前对于该分子发挥抑制作用的分子机制尚不十分清楚。探讨Tim-3调控天然免疫细胞的作用和机制仍是目前尚不清楚而迫切需要回答的课题。目的:针对上述研究背景及我们的前期研究基础,本论文的研究内容及目标有以下几个方面:1.明确Tim-3对巨噬细胞极化的调控作用;2.进一步确证Tim-3是否通过影响巨噬细胞极化影响疾病的进程,并通过干预实验评价将其作为新干预靶点的可行性;3.重点阐明Tim-3调控巨噬细胞极化的分子机制,为其应用提供理论基础。方法与结果:一.体外实验发现Tim-3显著影响巨噬细胞的极化。为了探讨Tim-3对巨噬细胞极化的调控作用,我们以RAW264.7巨噬细胞系和原代腹腔巨噬细胞(来源于野生型或Tim-3转基因小鼠)为研究对象,通过Tim-3敲低、过表达、功能阻断等实验手段,结合ELISA、Real-time PCR等方法,探讨了Tim-3对巨噬细胞炎症因子表达和极化的影响。结果发现:(1)Tim-3信号抑制巨噬细胞中炎症因子的表达。(2)Tim-3信号可以抑制M1型极化,促进巨噬细胞的M2型极化。二.在免疫相关性疾病,包括脓毒血症、肠炎及肠肿瘤中,阐明了Tim-3表达或功能改变、巨噬细胞极化异常和疾病的发生发展三者之间的内在联系。为了深入探讨Tim-3调控巨噬细胞极化与疾病的关系,我们用野生型及Tim-3转基因小鼠建立了与巨噬细胞极化失衡有关的三种疾病模型,即脓毒血症动物模型、溃疡性结肠炎动物模型和肠炎相关结直肠癌动物模型,并收集了相关的临床样本。主要研究内容包括:1)Real-time PCR、FACS等方法分析Tim-3表达、巨噬细胞极化和疾病病程之间的关系;2)通过转基因过表达或过继治疗等实验探讨体内干预Tim-3通路对巨噬细胞极化及病程的影响。实验结果有以下几个方面:(1)脓毒血症中,明确Tim-3通过抑制巨噬细胞向M1型极化,维持脓毒血症中巨噬细胞的极化平衡及体内免疫稳态,减轻病情进展。(2)溃疡性结肠炎中,发现Tim-3表达降低和巨噬细胞的M1型极化增强相关;通过Tim-3敲低的巨噬细胞过继转移可以加重溃疡性结肠炎的病情。(3)结直肠癌中,发现Tim-3表达上调和巨噬细胞M2型极化增强相关;在此基础上Tim-3转基因会通过加剧巨噬细胞的极化失衡、进一步加重肠癌的病情。三.阐明了Tim-3调控巨噬细胞极化的分子机制为了探讨Tim-3调控巨噬细胞极化的分子机制,我们基于前期研究基础,以各种细胞系,包括RAW264.7、CHO、293T、U2OS为主要研究模型,结合原代巨噬细胞,利用Tim-3敲低、过表达以及Tim-3融合蛋白功能阻断等实验手段,通过m RNA芯片、mi RNA芯片、Western blot技术、Real-time PCR、点突变、免疫共沉淀、高内涵分析等方法,从以下两个层面入手,重点探讨了Tim-3对巨噬细胞极化关键信号通路的影响,发现了一些全新的调控机制:1.发现Tim-3能通过上调A20表达、增强PI3K-AKT活性进而抑制LPS/TLR4诱导的NF-κB的活化;同时发现Tim-3还可以抑制IRF3的活化和IRF7的表达,参与对IRF3/7的调控。2.鉴定出Stat1是Tim-3调控巨噬细胞极化的胞内关键接头蛋白,证实Tim-3能通过抑制Stat1/mi R-155轴,上调SOCS1的表达,促进IL-10、Arg-1的表达,增强巨噬细胞M2方向的极化。结论:Tim-3是近年来新近鉴定出的一种免疫调控蛋白,被医学工作者认为是继CTLA-4、PD-1之后的新一代免疫调控靶点。很多研究集中在Tim-3对T细胞的调控作用。本研究的创新点在于我们率先证实了Tim-3对巨噬细胞,这一关键天然免疫细胞的稳态调控作用,并比较详细地阐明了Tim-3调控巨噬细胞极化的分子机制,为全面认识这一分子的调控功能提供了新的实验依据。巨噬细胞在体内广泛分布,为维持体内免疫稳态、维护机体健康发挥关键作用。通过阐明Tim-3在巨噬细胞极化调控中的作用及信号通路,为靶向巨噬细胞的免疫稳态调控策略提供了新的手段。尤为重要的是,通过阐明Tim-3、巨噬细胞极化和疾病病程之间的相关性,进一步明确了将Tim-3作为免疫相关疾病干预靶点的可行性,为相关疾病的临床干预提供了新的策略及思路。