肝移植是治疗终末期肝病的最佳选择,但术后排斥反应仍是影响患者生存的主要障碍。其中急性排斥反应则较为常见,约70%的肝移植患者有不同程度的急性排斥,是肝移植术后早期肝功能障碍的主要原因。急性排斥反应又称细胞性排斥,是由受体T淋巴细胞被供肝树突状细胞的异源性抗原激活后,受体T淋巴细胞活化聚集于供肝树突状细胞周围,通过分泌细胞因子引起的胆管上皮及静脉内皮细胞损伤。其免疫学表现为Th1细胞产生白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子分泌增加,病理学表现为汇管区混合细胞浸润,小胆管及静脉内皮坏死、脱落等,以术后7-14天最为明显。CD4+Th细胞可分化为Th1和Th2细胞亚群,其中Th1细胞因子通过促进同种抗原特异的细胞毒T细胞和迟发型过敏反应启动排斥反应,Th2细胞因子通过刺激B细胞增殖并产生特异性抗体在慢性移植物排斥反应中发挥作用。Th1/Th2两类细胞所分泌的细胞因子变化是免疫反应的指标,Th1细胞因子高表达可以诱导急性排斥反应,而Th2细胞则可通过抑制Th1细胞因子表达,下调Th1细胞的效应从而有利于免疫耐受的建立。因此Th1/Th2细胞通过彼此产生的细胞因子维持体内免疫状态的平衡,平衡失调则导致急性排斥反应或免疫耐受的发生。目前针对肝移植急性免疫排斥反应大多采用免疫抑制剂,但均不能完全抑制排斥并有诸多副作用。诱导外周免疫耐受减轻或阻止免疫排斥是一种较为理想的方法。骨髓间充质干细胞是一种多向分化潜能性与自我更新的细胞,具有独特的免疫学与替代学特性。替代学方面的研究认为骨髓间充质干细胞在体外具有向肝细胞、内皮细胞、上皮细胞分化的能力,而免疫学方面的研究认为MSC表达低水平的MHCⅡ类分子及Fas配体,不表达T细胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L,免疫原性较弱,不激活异基因活化的T淋巴细胞,因此骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用,可能诱导免疫耐受。受体骨髓问充质干细胞源于受体自身,容易获取、培养简单可反复采取,利用骨髓间充质干细胞的特性将受体骨髓问充质干细胞输注到移植肝内是否可以改善急性免疫排斥造成的损伤并可能抑制急性免疫排斥反应?因此本课题首先建立DA→Lewis的原位肝移植急性免疫排斥模型,将Lewis来源的骨髓间充质干细胞输注受体内,观测骨髓间充质干细胞在体内的分布、分化方向以及对肝内细胞因子的影响,以证实受体骨髓间充质干细胞输注在肝移植术后的作用。实验内容共分三部分:第一章大鼠同种异体原位肝移植模型的建立与病理学检测目的采用DA→Lewis大鼠组合建立肝移植急性免疫排斥模型,观测肝组织急性免疫排斥病理表现。方法①取SD大鼠80只,雌雄不拘,采用改良二袖套法建立原位肝移植模型,术后不予任何免疫抑制剂,观测术后生存状态。②取DA与Lewis大鼠各9只,采用改良二袖套法建立原位肝移植急性免疫排斥模型,术后不予任何免疫抑制剂。观察术后大鼠1d、7d、14d肝组织病理变化以及生存期。结果①原位肝移植模型SD→SD组合手术成功率为96%,术后长期存活(2mon)达90%。②SD→SD组合术后肝组织病理未见免疫排斥现象。③DA→Lewis组合可以产生典型的术后急性免疫排斥反应。④术后大鼠生存期较短,约为12d-16d。结论①改良二袖套法可以建立稳定的大鼠肝移植模型。②SD→SD组合非急性免疫排斥模型,术后可长期存活。③DA→Lewis组合是观测急性免疫排斥的典型组合。④术后如未予免疫抑制剂,Lewis大鼠生存时间短暂。第二章受体骨髓间充质干细胞的获取标记与体内示踪目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增方法,研究标记骨髓间充质干细胞的方法,观测标记后骨髓间充质干细胞输注在大鼠肝移植体内的短期与长期分布。方法①取4周龄约100克Lewis大鼠10只,分离两侧股骨与胫骨用L-DMEM/F12培养基冲洗髓腔。分别用密度梯度离心法与裂红法分离骨髓单个核细胞,贴壁培养法培养、扩增骨髓间充质干细胞。流式细胞仪鉴定第三代骨髓间充质干细胞的表面标记及细胞周期。②采用CFSE标记骨髓间充质干细胞,建模后经门静脉注入,于术后1d、7d、14d取肝移植模型肝、脾、肺、肾组织,荧光显微镜下观测体内分布情况,以正常Lewis大鼠为阳性对照。③采用Brdu标记骨髓间充质干细胞,建模后经门静脉注入,于术后14d、1mon、2mon取肝移植模型肝、脾、肺、。肾组织,行免疫组织学染色,观测体内分布情况,以正常Lewis大鼠为阳性对照。结果①原代培养24小时开始贴壁,10-14天时细胞贴满瓶底。②P3代培养细胞表型测定CD29阳性率95.3%,CD44阳性率94.7%,CD34阴性率1.8%,CD45阴性率为0.8%。③P3代培养细胞G0/G1期细胞约为82.9%,S+G2+M期的细胞为17.1%。④CFSE可快速高效的标记MSCs,标记率大于95%。⑤术后1d,7d,14d肝组织内有大部分CFSE标记的MSCs聚集,而脾肺肾组织中有CFSE标记的MSCs已经开始减少。⑥MSCs输注正常Lewis大鼠体内1d在肝脾肺肾组织中均有分布,5d后基本消失。⑦BrdU体外MSCs标记率约为95%。⑧肝脏为Brdu阳性细胞主要分布部位,脾肺肾组织仅有少量分布,术后14d、1mon、2mon肝内Brdu阳性细胞表达无明显减少,但术后1mon脾肺肾组织中Brdu阳性细胞消失。⑨正常Lewis大鼠体内1dBrdu标记MSCs偶见表达,在5d均为阴性表达。结论①采用红细胞裂解方法较采用密度梯度离心方法获取的MSCs更为简便。②通过密度梯度离心与红细胞裂解后联合贴壁培养法可获取较为纯化的MSCs。③CFSE是一种快速高效的细胞染色剂,受体MSCs输注移植肝短期内可特异性聚集于肝脏。④应用BrdU标记骨髓问充质干细胞是一种简单有效的标记方式,受体MSCs输注移植肝内长期分布仍以肝脏为主。第三章受体骨髓间充质干细胞输注对大鼠肝移植术后的影响目的观测输注受体骨髓间充质干细胞对大鼠原位肝移植的影响方法①取DA与Lewis大鼠各30只随机分为3组,A组:仅行原位肝移植术,B组原位肝移植术+MSCs,C组:原位肝移植术+CsA,每组10对。观测各组术后肝功能、比较生存时间差异。②于术后14d、1mon、2mon分别取各组肝组织标本,免疫组化双染色检测Brdu抗体与ALB抗体、CK19抗体、vWF因子抗体的共表达。③于术后1d、7d、14d、1mon分别取各组肝组织标本,采用Luminex液相芯片平台检测IL-2,IL-4,IL-10,IFN_γ等相关细胞因子在肝组织中的含量。结果①A组术后3d进行性恶化,术后10-16d自然死亡。B、C组大鼠在术后14d后逐渐好转,1mon后活动增多体重逐渐增加。②各组肝组织病理学变化A组呈重度急性排斥反应,B组呈轻度急性排斥反应。C组呈中度急性排斥反应。生存期比较B组、C组较A组生存时间明显延长(P＜0.05),B组较C组生存时间明显延长(P＜0.05)。③术后1mon、2mon肝组织内有Brdu与ALB及Brdu与vWF因子的共表达,未见Brdu与CK19的共表达。④各细胞因子IL-2、IL-4、IL-10,IFN_γ在术后1d、7d均有升高,但B组、C组低于A组(P＜0.05),术后14d、1mon B组细胞因子IL-4、IL-10浓度高于C组,B组细胞因子IL-2、IFN_γ浓度低于C组。结论①输注受体骨髓间充质干细胞在肝移植术后不同时期均可缓解肝功能,同时有助于延长生存期,其效果优于CsA。②肝移植术后输注受体骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,可以向肝细胞,血管内皮细胞分化,未向胆管上皮细胞分化。③MSCs可以改变T细胞亚群细胞因子的分泌量,在肝移植术后有利于免疫耐受的形成,MSCs的免疫抑制作用可能优于CsA。