背景和目的皮肤移植广泛应用于大面积的烧伤、创伤和外科整形手术。自体皮肤、同种异体皮肤、组织工程皮肤及异种异体皮肤是皮肤移植的主要皮肤来源。自体皮肤移植是修复伤口并且恢复其生理性功能最理想的方法,但是需要在有限的供皮区域内进行多次取皮,以致于自体的皮肤来源往往不足。同种异体皮肤移植已经在临床上应用了数十年,并成功抢救了数以万计的生命。新鲜的尸体是同种异体皮肤移植主要的来源,其主要的优点是起到生理屏障的作用,不但减低了感染的风险,而且还有利于防止蛋白、水、热量以及电解质的丢失。然而,同种异体皮肤移植的运用尚存在很多的问题,其中包括传播疾病的可能性,不能永久运用以及供应受限等。组织工程皮肤是人们为解决皮源问题而发明的皮肤代替品,它们可以暂时地覆盖伤口以防止脱水和保持伤口的湿润,但是并不能永久性地作为伤口的修复皮肤,更不能用于大面积或深度的烧伤或者创伤。异种皮肤主要来源于猪皮,有人制备了一种脱细胞异种(猪)真皮基质,但仅仅起到一定的屏障作用。虽然异体皮肤移植取得了很大的研究进展,但远远未能达到人们预期期望的效果。随着异体皮肤的需求逐渐增加,寻求新的皮源显得非常有必要。畸胎瘤多发于性腺和机体的中轴及中轴旁部位,常发生在卵巢、睾丸,亦可发生在胃、前列腺、腹膜后、颅内、骶尾部等部位。卵巢成熟性畸胎瘤是卵巢生殖细胞肿瘤中最为常见的良性肿瘤,其来源于外、中、内多胚系。卵巢成熟性畸胎瘤内通常含有皮肤样的组织,显微镜下可见复层鳞状上皮、皮脂腺、及毛囊等组织结构,与正常皮肤组织类似。然而,目前对于畸胎瘤内的这种皮肤样组织的研究甚少,其是否能作为新的皮源用于皮肤移植是一个值得探讨的问题。本课题主要研究目的是:(1)分析畸胎瘤瘤皮的免疫学功能;(2)检测P53和P16基因在卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮、皮肤鳞状细胞癌及畸胎瘤鳞状细胞癌恶变组织中的表达及差异,分析卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮恶变的几率;(3)通过畸胎瘤瘤皮裸鼠皮肤移植实验,观察和分析其是否可以用于修复缺损的皮肤;(4)对移植后的畸胎瘤瘤皮进行CyclinD1、P53、P16、P21和c-Myc基因的检测,以进一步分析移植后瘤皮是否发生恶变。方法第一章 卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮与正常皮肤免疫功能的比较1.选取畸胎瘤瘤内皮肤样组织20例,其来源于南方医科大学附属南方医院妇产科因卵巢成熟性畸胎瘤而行手术治疗的患者;正常皮肤10例,来源于南方医院乳腺治疗中心由于乳腺癌而行根治术的患者。组织标本一部分置于10%中性甲醛固定,而另一部分的标本置于RPMI1640培养基中在4℃温度下保存备用。2.行CD1a、CD83、CD68、CD4、CD8及DR的免疫组织化学染色,观察瘤皮和正常皮肤中朗格汉斯细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞的数量和分布情况3.制备畸胎瘤瘤皮和正常皮肤组织透射电镜的样本,通过透射电镜,观察这两种皮肤组织中免疫细胞的超微结构。第二章卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮恶变率及P53和P16表达1.查阅南方医院近10年临床标本资料,收集并统计到卵巢成熟性畸胎瘤和发生鳞状细胞癌恶变病例数,并行P53和P16免疫组化;2.选取25例移植成功的畸胎瘤瘤皮和20例皮肤鳞状细胞癌,通过免疫组化方法检测其P53和P16蛋白的表达,并用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行定量分析。第三章 卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮裸鼠移植实验1.手术室取回新鲜的畸胎瘤瘤皮20例,共移植裸鼠30只。瘤皮移植过程:将畸胎瘤瘤皮的皮下脂肪组织尽量剪除掉,保留完整的上皮组织;然后,通过裸鼠腹腔注射1%的巴比妥钠麻醉液进行全身麻醉,取侧卧位,皮肤经过消毒后,于裸鼠的侧背部剪去面积约1cm2的皮肤及其皮下脂肪,筋膜完整保留,从而皮肤移植床制备完成;最后,再将预先制备好的移植物放于移植床上并且要与裸鼠的皮肤相吻合,将带毛发一面朝上,而另一面朝下,再用7-0尼龙手术缝线进行间断地缝合,用镊子将创缘对齐,凡士林纱布覆盖于其上,包上创可贴,标记后单笼饲养。移植术后,对受移植的裸鼠进行外观形态及一般状况观察,直到小鼠自然死亡后。2.愈合皮肤来源的鉴定:行HE染色和黑色素染色,显微镜下形态观察鉴定;通过HLA-ABC和Vimentin的免疫组织化学染色分别从表皮和真皮阳性表达差异对愈合皮肤组织来源进行鉴定。第四章 畸胎瘤瘤皮移植后Cyclin D1、P53、P16、P21和c-Myc基因的检测及裸鼠脏器的观察1.选取25例移植成功的畸胎瘤瘤皮作为实验组,20例皮肤鳞状细胞癌作为对照组,通过免疫组化和原位杂交方法对这两种组织分别从蛋白和基因水平进行 CyclinD1、P53、P16、P21 和 C-Myc 基因的检测。2.对25例畸胎瘤瘤皮移植成功的裸鼠在观察终点时,用1%的戊巴比妥钠麻醉处死,全身解剖取出脏器后放入10%中性甲醛中固定,经过常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片步骤后,行HE染色观察受移植裸鼠脏器是否有转移灶的形成。结果第一章 卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮与正常皮肤免疫功能的比较1.免疫组化结果显示,在畸胎瘤瘤皮及正常皮肤的表皮中,均可见CD1a阳性表达的朗格汉斯细胞,突触明显,形态结构相似,其数量在这两种皮肤中相当,差异没有统计学差异(P=0.963);CD83表达均为阴性,表明畸胎瘤瘤皮表皮中的朗格汉斯细胞与正常皮肤一样,均为未成熟的朗格汉斯细胞;CD68、CD4、CD8免疫组化结果表明,畸胎瘤瘤皮及正常皮肤的巨噬细胞和T淋巴细胞的数量及分布情况相一致,差异同样不具有统计学差异(P=0.557,P=0.565,P=0.096)。2.电镜下观察,正常皮肤中可见朗格汉斯细胞;畸胎瘤瘤皮也可见朗格汉斯细胞,其形态与正常皮肤的朗格汉斯细胞相似。第二章 卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮恶变率及P53和P16表达1.经查阅南方医院近10年临床标本资料,共收集到卵巢成熟性畸胎瘤病例1913例,其中畸胎瘤内出现鳞状细胞癌仅2例,恶变率0.1045%。免疫组化结果显示,2例畸胎瘤中鳞状细胞癌恶变中均有P53表达,其中1例P16过表达。2.25例畸胎瘤瘤皮中P53和P16均无表达,而20例皮肤鳞状细胞癌中11例P53过表达,7例P16过表达。P53和P16在皮肤鳞状细胞癌的阳性率分别为55%和35%,均明显高于畸胎瘤瘤皮之阳性率0%,差异有统计学意义(P<0.001,P=0.002)。3.定量分析结果表明P53和P16在皮肤鳞状细胞癌中的染色强度明显均强于畸胎瘤瘤皮,PU值差异均具有统计学意义(P值均<0.001)。第三章 卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮裸鼠移植实验1.移植裸鼠共30只,成功13只,总成功率约为43.33%。移植后瘤皮的大体形态发生较大变异,愈合皮肤有的呈暗黑色,有的呈褐色,部分瘤皮大约在一个月后开始长出毛发,随着时间的延长,毛发逐渐地长长,而瘤皮面积大小不等。2.HE染色显示愈合的瘤皮组织包含真皮与表皮,表皮为角化的鳞状上皮,上皮层较厚,约5～6层,表皮突明显,真皮层可见毛囊、皮脂腺及汗腺;而周围的裸鼠皮肤表皮较薄,约2～3层,真皮层较薄,其中可见毛囊及皮脂腺,而无汗腺结构。黑色素染色显示裸鼠表皮细胞中无黑色素黑色素颗粒,而瘤皮基底细胞层和棘细胞层中可见黑色素颗粒。免疫组化结果显示,HLA-ABC抗原在瘤皮表皮为阳性表达,而鼠皮呈阴性。在真皮层中,Vimentin抗原显示瘤皮间质呈阳性,鼠皮间质呈阴性,瘤皮与鼠皮间质分界清晰。因此,根据镜下形态、黑色素染色、HLA-ABC和Vimentin免疫组化结果,可以证实愈合的皮肤来源于人源性表皮和真皮组织成分,即是移植的畸胎瘤瘤皮。第四章 畸胎瘤瘤皮移植后Cyclin D1、P53、P16、P21和c-Myc基因的检测及裸鼠脏器的观察1.免疫组化结果显示,25例瘤皮中2例Cyclin D1、4例P21和3例c-Myc阳性表达,P53和P16均阴性表达;而25例皮肤鳞状细胞癌中11例Cyclin D1过表达、11例P53过表达,7例P16过表达,9例P21过表达,12例c-Myc过表达。在皮肤鳞状细胞癌的阳性率均明显高于畸胎瘤瘤皮,差异有统计学意义(P=0.001,P<0.001,P=0.002,P=0.033,P=0.001)。2.原位杂交结果显示,25例瘤皮中1例Cyclin D1和2例P21阳性表达,c-Myc、P53和P16均阴性表达;而25例皮肤鳞状细胞癌中8例Cyclin D1过表达,7例P53过表达,5例P16过表达,7例P21过表达,6例c-Myc过表达。在皮肤鳞状细胞癌的阳性率均明显高于畸胎瘤瘤皮,差异有统计学意义(P=0.003,P=0.002,P=0.013,P=0.015,P=0.005)。3.观察终点时,取出裸鼠的内脏器官行HE染色,在显微镜下观察其病理形态学的改变。大体观察裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和脑均未见转移灶的形成。结论1.卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮与正常皮肤免疫细胞的数量、分布规律和超微结构有很大的相似性,我们推测瘤皮具备基本的皮肤免疫功能。2.中国人成熟性畸胎瘤瘤皮发生恶变的几率极低,约为0.1%;P53和P16表达于皮肤鳞状细胞癌和畸胎瘤鳞状细胞癌恶变组织,卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮中未见P53和P16的异常表达,这或许是成熟性畸胎瘤恶变率低的重要原因。3.卵巢成熟性畸胎瘤瘤皮移植至裸鼠表面可获得成功,移植后的畸胎瘤瘤皮组织可长出毛发,真皮内可见与正常皮肤类同的皮肤附属器结构,表明移植后的瘤皮具备一定的生理功能,可用于组织修复。4.移植后畸胎瘤瘤皮Cyclin D1、P53、P16、P21和c-Myc在蛋白及基因水平上均未见异常表达,全身内脏器官均未形成转移灶,表明畸胎瘤瘤皮移植后不会引起肿瘤的发生。