骨性关节炎,作为一种常见的关节退行性疾病,具有如下几个主要特点：关节软骨细胞的分化及成熟,细胞外基质的进行性降解,关节软骨成分的进行性丢失以及关节内骨赘的形成。在位于生长板处的软骨之中,软骨细胞的成熟分化以及基质成分转变都十分迅速,与此截然不同的是,在关节处的软骨组织能够长期保持稳定的形态及特性,同时,发生于关节软骨内软骨细胞及细胞外基质的转变也非常微弱。在正常的生理条件下,在出生后的整个生命阶段,关节软骨内的软骨细胞的形态以及功能都维持在一个稳定的状态。如上所述,与生长板内的软骨细胞不同,关节软骨内的软骨细胞参与维持细胞外基质的稳定,并且不会像生长板内的软骨细胞那样分化成熟从而达到肥大状态。然而,在骨性关节炎的疾病进展过程中,关节软骨内的软骨细胞开始进行增殖进而聚集形成细胞群簇,同时这些软骨细胞分化成熟,并表现为如同在生长板中所见到的肥大状态。与此相一致的是,此时的软骨细胞开始表达成熟期标记物的基因,例如10型胶原(Co1X)以及基质金属蛋白酶13(MMP-13)。此外,在发生骨性关节炎的关节软骨组织中同时可以检测到其他基质金属蛋白酶以及蛋白聚糖酶(例如ADAMTS-4口ADAMTS-5)的表达。这些酶类依次对基质中的成分进行降解,从而导致关节软骨的退变。在骨性关节炎的进展过程中,在未被破坏的关节软骨内,软骨细胞的代谢非常活跃,并大量地表达蛋白多糖以及胶原蛋白,这种状态一般被认为是在试图修复被破坏的细胞外基质。随着骨性关节炎的进一步发展,原本被软骨钙化区所覆盖的软骨下骨被暴露出来,同时,关节边缘处开始形成骨赘,并最终将关节腔桥接起来。作为一种与年龄相关的进行性退行性关节疾病,骨性关节炎是最为常见的导致肢体活动障碍的原因,并影响了全球近5000万人口。但是,关于骨性关节炎的致病因素以及潜在的发病机制还有许多问题有待回答,此外,到目前为止,仍未发现能够有效治疗骨性关节炎的药物。构建动物疾病模型是研究疾病潜在的发病机制的重要方法。为了模拟并研究骨性关节炎的发病机制,到目前为止,人们已经进行了大量的研究实验,建立了各种不同类型的骨性关节炎动物疾病模型。在这些不同类型的动物疾病模型之中,在小鼠中建立的动物疾病模型尤其重要,这是因为,通过使用经过基因工程修饰过的小鼠,可以明确某个基因在疾病中的作用,同时,使用小鼠作为构建疾病模型的对象,相对于其他大型动物,在模型构建效率以及动物实验管理方面更具有优势。然而,在手术诱导骨性关节炎小鼠动物疾病模型的过程中,有多种因素可以影响动物疾病模型间的一致性,以至于手术诱导小鼠动物疾病模型的应用受到了极大的限制。在不同种类的实验性小鼠骨性关节炎疾病模型之中,内侧半月板不稳小鼠骨性关节炎疾病模型对多种关节炎相关分子在骨性关节炎发病机制中的病理生理作用的体内研究具有非常重要的意义。该小鼠骨性关节炎疾病模型具有良好的可重复性,并且在该模型中骨性关节炎的疾病进展过程相对较慢,相对于其他动物疾病模型更接近于骨性关节炎的实际临床表现,这对于研究不同的治疗方式以及不同的基因修饰对于骨性关节炎疾病进展过程的影响具有极其重要的意义,因此小鼠内侧半月板不稳模型被研究者广泛接受,并应用于骨性关节炎的实验研究之中。但是,小鼠内侧半月板不稳动物模型的构建过程较为复杂,而且目前尚没有关于这一动物模型构建方法的详细的、具体到实验步骤细节的研究报道。因此,我们在本研究中利用野生型以及生长因子progranulin (PGRN)基因敲除小鼠作为实验对象,介绍通过手术建立小鼠内侧半月板不稳动物模型的详细方法,同时通过建立该骨关节炎动物疾病模型诱导骨性关节炎,然后比较模型建立后两种基因型小鼠骨性关节炎发病及疾病进展的差异。本实验中,在小鼠膝关节所进行的手术包括两种：一种是假手术,即仅仅将膝关节囊切开,对膝关节中的所有结构不作任何处理；另外一种是内侧半月板不稳手术,在该手术过程之中,切开膝关节囊之后,进一步切断连接内侧半月板及胫骨平台的韧带,从而造成内侧半月板的不稳定。在手术后的特定时间,通过组织学检测(例如Safranin-O染色检测),骨性关节炎相关基因表达检测,关节软骨细胞外基质分子降解检测以及骨赘形成检测等手段,评定骨性关节炎的严重程度。实验结果显示,内侧半月板不稳手术成功地在野生型小鼠以及PGRN基因敲除小鼠中诱导了骨性关节炎的发病及进展,同时,缺乏生长因子PGRN的小鼠在疾病诱导后出现了相对野生型小鼠更为严重的骨性关节炎表现。Progranulin(PGRN),作为一种可以诱导软骨形成的生长因子,在之前的研究中被发现能够与软骨基质中的基质蛋白相结合,并且保护软骨基质蛋白不被相应的基质蛋白酶降解。同时,有研究发现,在骨性关节炎患者的软骨组织中,PGRN的表达水平出现了显著的提高。有研究表明,在小鼠炎症性关节炎疾病模型中,PGRN可以通过与肿瘤坏死因子α (TNF-α)竞争性结合肿瘤坏死因子受体,对TNF-α产生拮抗作用,从而保护关节软骨不被炎性因子破坏。然而,目前仍然没有体内实验能够表明PGRN在骨性关节炎发病、疾病进展以及关节软骨的降解中的具体作用,关于该问题的回答,仍需要进行相应的研究。在本课题实验中,我们发现随着年龄的增长,在PGRN基因敲除小鼠的膝关节中出现了相对于野生型小鼠进展更加迅速的白发性骨性关节炎样表现,具体包括关节软骨细胞的退变,关节软骨细胞外基质的降解,软骨结构的丢失以及骨赘形成。我们进一步通过建立不同的手术诱导骨性关节炎小鼠模型来研究PGRN在骨性关节炎中的作用,缺乏PGRN的小鼠表现出更为严重的关节软骨结构破坏以及骨性关节炎进行性加重,另一方面,通过在膝关节局部进行重组PGRN蛋白注射治疗,关节软骨降解的降解以及骨性关节炎的进展都有了明显的减弱。此外,通过使用PGRN处理体外培养的原代关节软骨细胞,我们发现,PGRN可以激活ERK1/2信号通路,从而提高软骨细胞合成代谢标志物的表达水平,而这一作用主要是通过肿瘤坏死因子受体2来完成的。另外,我们还发现,在关节软骨组织以及软骨细胞中,PGRN可以抑制TNF-α的炎性作用以及β-catenin信号通路的激活。基于本课题研究实验结果以及相关文献报道,我们可以对PGRN在骨性关节炎进展过程中的作用以及调控机制进行大致的概括。PGRN在骨性关节炎的进展过程中具有保护性作用,这一作用是通过多种途径来实现的。首先,PGRN可以激活软骨细胞内的ERK1/2信号通路,并提高软骨细胞合成代谢标志物的表达水平,包括Ⅱ型胶原蛋白以及蛋白聚糖,从而增强软骨细胞的合成代谢,并以此来重新平衡在衰老和创伤过程中增强的分解代谢对软骨细胞整体代谢水平的影响。第二,众所周知,TNF-α可以提升多种分解代谢标志物的水平,例如MMPs以及ADAMTS,从而参与介导骨性关节炎病变过程中的软骨降解。PGRN可以通过与TNF-α相互作用,减弱TNF-a所介导的软骨细胞外基质基质降解蛋白酶的表达以及软骨结构的丢失,进而发挥对关节软骨的保护作用。此外,β-catenin信号通路被认为在骨赘形成的过程中具有重要作用,PGRN还可以通过参与调节β-catenin信号通路,抑制该信号通路所介导的关节软骨退变。综合本课题的所有实验结果,本课题研究不仅揭示了生长因子PGRN及其相关分子之间的相互作用在软骨及退行性关节炎中的重要意义,而且为研发治疗退行性疾病的新型药物提供了方向。综上所述,本课题所得的实验结果数据表明PGRN在骨性关节炎的发病机制中具有极其重要的作用。此外,PGRN以及其衍生物可能代表着对骨性关节炎以及其他软骨相关的退行性疾病的新型的治疗干预手段。