研究背景和目的创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)不仅导致皮层细胞死亡,也会诱导继发性海马细胞死亡。创伤性脑损伤是神经外科常见病,在我国年发病率为55.4人/10万人口,并呈逐年上升趋势。TBI常见的后遗症包括外伤后癫痫和记忆障碍等,严重影响了患者的生活质量,这些后遗症发生的神经学基础尚不清楚。单侧的打击可以通过脑组织传递到对侧,但是在通过脑组织和其他颅内组织时压力显著减小,所以液压打击对对侧脑组织的影响较小。以前已有报道创伤性脑损伤诱导的海马区高兴奋性,但是多数研究集中在对海马齿状回创伤后神经网络改变的研究。针对齿状回创伤后出现的高兴奋性,人们提出了不同理论。Lowenstein等发现,对单侧脑半球的打击可引起海马齿状回颗粒细胞的高兴奋性和表达生长抑素的海马齿状回门(hi-lar)细胞的减少,提出了齿状回门细胞的“选择性易损伤”学说。Santhakumar等认为,创伤后齿状回门中间神经元并没有选择性易损伤,认为门结构对于损伤后齿状回颗粒细胞活动的加强是必需的,创伤后门结构中的苔藓细胞对来自perforant通路的刺激反应增强,由此提出了“易激惹苔藓细胞”假说。因此,海马齿状回一直被认为滤过异常传入信号进入CA3区的一道屏障,CA3区将传入的信号进行扩大,然后通过CA1区将信号传递到大脑皮层。因此,在CA3和CA1之间进行切断,有助于减少创伤后来自齿状回的异常上位传入信号对CA1区神经元兴奋性的影响,更易于相对独立研究CA1区的Schaffer侧支单突触传递通路。脑损伤是神经外科医师工作中常见的问题,多见于机械性撞击、交通事故、暴力侵害造成。脑损伤不但夺去为数不少人的生命,而且还造成大量脑外伤后遗症,构成对患者家庭及社会的沉重负担。建立脑损伤(TBI)动物模型的方法主要有两大类：液压冲击模型(FP)和控制性脑皮质撞击模型(IC)。脑损伤除造成脑结构形态破坏,缺氧缺血神经细胞坏死外,尚可发生大量神经细胞凋亡。众所周知,神经细胞凋亡不同于坏死,它是正常生理状态下细胞死亡模式。海马结构具有高度有序化的板层且各种神经成分相对独立分布,可作为研究脑的理想模型。海马结构由海马、齿状回、下托(subiculum)、束状回和灰被组成。它从室间孔处延至侧脑室下角顶部,全形呈弓形,属古皮质。以胼胝体为标志可把海马结构分成上、下部。海马皮质可分为多形层、锥体层和分子层。锥体细胞规则排列的形式决定了整个海马的结构模式。就整体来讲海马的结构是比较一致的,但依据细胞构筑的不同可再将其划分成四个区,分别命名为CA1、CA2、CA3和CA4区,“CA”是Am-mon角(cornu ammonis)的缩写。CA4紧邻齿状回,CA1与下托相连接。海马在人类和实验动物模型中是TBI后最脆弱的脑部区域之一。海马结构是研究较多的与学习记忆有关的脑区,它不仅和陈述记忆有关,而且还涉及认知功能和位置导航,是一个重要的信息处理部位。大量研究已证明与学习记忆特别是空间认知功能有关。尤其CA3区被认为与空间辨别性学习记忆活动的关系尤为密切。在动物实验中,人们发现损毁海马能促进操作性逃避的学习,但可减弱在“T”迷宫逃避足部电击的视觉辨别问题的学习。也有实验结果表明,海马突触体内游离钙特异性的升高与动物学习记忆的减退相一致。双侧海马损伤的患者,当他们在一段时间内集中注意力,虽可记住一个短句或一个短位数字,但当患者把注意力转向某些其它事物时,即使是片刻,也将完全忘记这个短句或短位数字。这种障碍使患者不能学习新事物,也不能记忆最近的经历,但对发病前获得的技能以及生活中曾发生的事情,仍有良好记忆。海马与记忆有着密切的联系,海马通过脑干网状结构系统及皮质下行纤维接受来自视、听、触、痛等多种感觉信息,并参与调节内分泌活动。我们之前发现,中度TBI后,海马中多数死亡细胞主要仅限于海马齿状回,海马齿状回内神经形成在整个生命周期内都是持续不断的。细胞类型和细胞生成分析发现,海马齿状回内死亡的细胞是新生2～3周的未成熟颗粒神经元。1973年Bliss第一次发现在家兔海马齿状回具有强直刺激引起突触功效的强直后增强现象,当用短串高频电刺激海马的兴奋性传入神经时,海马突触传递可在数秒钟内增强,且持续时间在10h以上,特称之为长时程增强(LTP)。LTP是突触活动的易化现象,被视为突触可塑性的一个模式,习惯上把具有这种性质的突触称为可塑性突触。肖鹏等进一步验证了LTP出现的快慢与条件反应建立的快慢(个体差异)相吻合,即在明暗辨别学习中出现突触效应长时程增强,保持时间的长短与巩固性训练的多少呈正相关,且LTP消退,习得性行为也消退。结果发现,在条件反应的建立过程中,产生突触效应LTP；在条件反应的巩固过程中,LTP继续保持；当条件反应消退,LTP也消退；在条件反应的再建立过程中,再次产生LTP,而且这种习得性LTP的发展和变化超前于习得性行为的产生和改变。以上资料表明LTP可能是学习记忆的神经基础,特别在运动学习过程中对新的神经回路的形成起着重要作用。本研究结果表明,TBI后大多数的新生神经死亡发生在24h内,然后在一个低水平保持至少2w。死亡的未成熟粒细胞多数没有表现出细胞凋亡形态特征,凋亡标记物几乎显示阴性。相反,他们共同表达受体相互作用蛋白(RIP-1,一种坏死标记物)显示未成熟的神经细胞因坏死而死亡。从而表明,中度TBI可引发海马内未成熟神经元的快速坏死性死亡。学习记忆是神经系统特别是中枢神经系统各部相互作用,共同完成的复杂过程。不仅依赖于神经元构成的复杂网络性的多层次神经元环路,而且还依赖于环路中每个神经元的神经介质的正常调节。研究显示海马结构与学习记忆,特别是空间辨别性学习记忆功能关系密切,海马结构内构成了明确的突触通路,海马内突触通路的完整对各类学习记忆的功能是非常重要的。提示防止海马内细胞死亡的治疗应以未成熟神经细胞作为目标,在损伤后24h内给予治疗,以阻断细胞坏死过程。颅脑是人体最重要的器官,脑损伤后如何挽救尚有活力的神经细胞,减少迟发性死亡,尽量保护神经功能,是每一位神经科医生都要面对的难题。近年来,分子生物学研究发现,海马作为脑损伤后易损区,出现神经细胞延迟性死亡。目前,国内外有关这一领域的研究大多局限于缺血性脑损伤,有关脑损伤后这一领域的研究机制尚无全面的报道。聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(poly adenosinediphosphate ribose polymerase, PARP)被认为跟凋亡过程的启动相关,在实验鼠TBI后,PARP阳性细胞主要出现在海马CA3区的锥体细胞层,海马CA3区的锥体细胞层神经元在经典的海马三突触回路中有着重要作用和地位,无论是齿状回颗粒细胞层-经苔状纤维-投射至CA3区锥体细胞层,还是CA3区锥体细胞层-经谢弗侧支-投射至CA1区锥体细胞层,都与CA3区锥体细胞层相关联,海马三突触回路是学习、记忆的基本结构,本实验中,由于TBI致伤区域及海马本身的形状结构使得海马CA3区锥体细胞层是间接受损较早且较严重的部位,因为海马三突触回路的受损,从而引起TBI后学习记忆能力的下降。研究方法本实验采用了美国杰克逊实验室8-11周龄的雄性C57BL/6小鼠48只,分组饲养并进行中度可控性大脑皮层损伤(随机分为TBI术后4h,24h,48h,3d,7 d和14 d,非手术组以及对照组共8组,每组6只),摘除脑部并用4%多聚甲醛(PFA)固定过夜,然后用30%的蔗糖抗冻保存48h,用冰冻切片机(Microm HM 500 M)进行连续冠状切片(30μm厚)并于-20℃保存,随后对切片进行Fluoro-Jade B染色、免疫组织化学分析、原位末端转移酶标记(TUNEL)检测、定量分析和统计分析,用连接数码相机(Zeiss Axio Cam MRc5, Carl Zeiss Microlmaging公司)的荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200 M CarlZeiss MicroImaging公司)对切片进行分析。用成像软件对图像进行捕获(AxioVision,4.0, Carl Zeiss MicroImaging公司)并用Photoshop 7.0进行组合与标记；观察了中度创伤性脑损伤对小鼠海马未成熟神经元学习和记忆能力的影响作用；探讨了海马结构的可塑性与学习记忆的相关性；证实了许多细胞因子和生化物质参与脑外伤后继发性脑损伤与抗损伤的病理生理过程,碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)作为多种神经生长因子,可能与神经营养和再生、血管再生、创伤愈合等密切相关,能保护神经元对抗缺氧、低血糖、兴奋性氨基酸、钙超载、自由基和一氧化氮等多种损伤,防治和减少继发性脑损害,提高脑损伤的救治效果；研究了对创伤性脑损伤海马神经元死亡的量化评估,海马作为大脑边缘系统,与记忆相关性的探讨正成为研究的热点,损伤引起迟发性神经元坏死是近年来备受关注的课题；表明了中度创伤性脑损伤会引发海马中不成熟神经元坏死性死亡,防止海马内细胞死亡的治疗方法应通过阻断坏死的过程,并且以保护未成熟神经细胞作为治疗目标,最好在损伤后24h内进行。研究结果1、中度创伤性脑损伤后海马继发性细胞死亡主要发生在颗粒细胞层.当我们通过一种广泛用于死亡神经元染色的Fluoro-Jade B染色方法研究TBI 24h后海马内细胞死亡情况时,主要在病灶周围区域和同侧海马内(图1a)观察到被FJB染成绿色的死亡细胞。海马病灶FJB-阳性细胞的平均数量为359±21 N/mm3。在对侧皮层没有观察到FJB-阳性细胞。更高放大倍数的照片显示,FJB-阳性细胞不是均匀地分布在海马内-(图1b-d),相反,他们主要位于海马齿状回(图1 a-d)。海马内不同区域由不同类型的细胞组成,它们可能对外伤性创伤有不同的敏感性。我们进一步评估了TBI 24h后海马内不同亚区内FJB-阳性细胞的分布。于TBI 24h后,颗粒细胞层(GCL)有291±19 N/mm3 FJB-阳性细胞,占海马中死亡细胞总数的80.9%,然而在CA1有0.15%；在CA3有11.42%,在海马门有5.04%,在分子层(MCL)有1.65%(图1,饼状图e)。尽管海马中FJB-阳性细胞总数明显地从创伤性脑损伤后24h的359±21 N/mmm3明显地减少到3d后的55±3 N/mm3,创伤性脑损伤3d后的FJB-阳性细胞在海马不同亚区的分布与创伤性脑损伤24h后的分布非常相似。颗粒细胞层(GCL)有80.02%,CA1有2.37%；CA3有12.80%；海马门有0.84%；在分子层(MCL)有0.96%(图1,饼状图f)。为了评估沿海马齿状回的死亡细胞分布格局,我们量化了中心区域,以及中心区域头端和尾端的FJB-阳性细胞密度。中心区域的死亡细胞密度最大,死亡细胞的密度向头端和尾端方向慢慢降低(图1g)。2、创伤性脑损伤后齿状回颗粒细胞层(GCL)神经元死亡的时域分布。在损伤后的最初4h,我们观察到在齿状回颗粒细胞层(GCL)有相当多数量的FJB-阳性细胞(32008.5±5584.3 N/mm3,N=6),FJB-阳性细胞数量峰值出现在24h(38131.9±4858.2 N/mm3,N=6),48h急剧下降(9150.3±1763.8 N/mm3, N=6,P=0.008,与24 h组相比),第14d降到非常低的水平(第3d,5840.9±736.1 N/mm3,N=6；第7d,5945.0±1509.8 N/mm3,N=6；第14d,921.8±666.6 N/mm3,N=6)(图2)。3、未成熟的新生神经元对创伤性脑损伤的耐受性。创伤性脑损伤后4h,在颗粒细胞层有大量的FJB-阳性细胞(图3a,b,d,和e)。大多数的FJB-阳性细胞位于颗粒细胞层内三分之一处(图3a,b,d,和e),其中有大多数未成熟的新生颗粒神经元存在。正如预期,NeuN阳性成熟颗粒神经元位于颗粒细胞层高厚度方向上(图3a),相反,NCAM阳性未成熟颗粒神经元位于颗粒细胞层内三分之一处(图3d)。更高功率的图像(图3 b)和三维重建图像(图3c)表明,大多数FJB-阳性细胞不与NeuN标记物共存,表明颗粒细胞层大部分FJB-阳性细胞不是成熟的颗粒神经元。相反,更高分辨率的图像(图3 b)和三维重建图像(图3c)表明,大部分FJB-阳性细胞与NCAM阳性细胞共存,表明中度创伤性脑损伤后4h颗粒细胞层的大部分死亡细胞是不成熟的颗粒神经元。创伤性脑损伤7d后,颗粒细胞层的FJB-阳性细胞的数量明显减少(图3g和j),研究结果支持此结论,即齿状回细胞死亡主要发生在创伤性脑损伤后24h内,且创伤性损伤后24h后急剧减小。更高分辨率的图像(图3h)和三维重建图像(图3k)表明：大多数FJB-阳性细胞都不与NeuN共存,而是与NCAM阳性细胞共存。4、中度TBI后海马细胞的死亡类型主要是坏死。我们在对侧海马没有观察到显著的RIP-1表达(图6a,c,e),然而,在同侧的海马区的FJB-阳性颗粒细胞有显著的RIP-1表达(图6b,d,f),合并后的图像显示,FJB-阳性细胞(图6b)与RIP-1信号同时存在(图6 f),用三维重建技术和高倍放大的图像可见FJB-阳性细胞高度表达的RIP-1(图6 g-j)。定量分析表明,在FJB-阳性细胞中,有78.6±5.1%的细胞同时表达了RIP-1,这意味着有高比例的细胞死于坏死死亡,这些结果可作为创伤性脑损伤后海马内未成熟神经元坏死死亡的支持证据。在CA1区观察到大量裂解的活性caspase-3阳性细胞(补充图A)。我们在颗粒细胞层没有观察到任何TUNEL阳性细胞(补充图B),但是,在同一个切片大脑皮层上有相当数量的TUNEL阳性细胞,相反,同样作为阳性对照,抗酶前处理的脑切片显示在海马和大脑皮层上有大量的TUNEL阳性细胞(补充图),我们进一步考察了HDG的FJB-阳性细胞和胞核的形态,发现它们中大部分表现为细胞核轻微固缩但没有明显碎裂(图5)。以上研究表明：继发性细胞死亡主要发生在中度TBI后24h内。为进一步确定这一分布形式是发生在创伤性脑损伤后24h内或在24h后继续保持一致?我们研究了损伤3d后的细胞死亡及其分布,中度的可控性大脑皮层创伤性损伤后,海马继发性死亡主要发生在颗粒细胞层。假手术组和空白对照组未见明显的死亡阳性细胞；TBI后海马齿状回内的细胞死亡发生非常迅速,超过80%齿状回颗粒细胞层(GCL)的细胞死亡发生在中度TBI后的24h内,齿状回颗粒细胞层(GCL)神经元死亡的时域分布表明,防止神经细胞死亡最佳治疗时间窗为损伤后4h,且不能迟于损伤后24h；不仅在TBI后的最初几个小时,甚至在TBI后数天当细胞死亡率减小后,未成熟的神经元对创伤性脑损伤的耐受性仍是高度脆弱的,在创伤性脑损伤7d后,颗粒细胞层死亡细胞中大多是未成熟颗粒神经元,只有一小部分是成熟的颗粒神经元；颗粒细胞层中没有检出细胞凋亡,颗粒细胞层不成熟神经元可能不是死于细胞凋亡。综上所述：TBI后海马实验小鼠经一段时间(4h,24h,48h,3d,7d和14d),发现4h最多新生细胞死亡,继发性细胞死亡主要发生在中度TBI后24h内,随时间延长有不同程度的新生和成熟细胞死亡。提示临床病人可以争取宝贵的抢救时间,有效地预防和控制海马细胞死亡,保护其生理功能。创伤性脑损伤后,新生神经元是随着时间的推移继续死亡,还是在创伤性脑损伤后期,细胞死亡会从新生神经元死亡转变为成熟细胞死亡有待研究。为此,我们通过组合使用针对成熟神经元和不成熟神经元的不同抗体的FJB染色和免疫染色,对颗粒细胞层中受影响的神经元类型进行了进一步评估,创伤性脑损伤后用NeuN针对成熟的神经元,用NCAM针对未成熟的神经元分别染色2周。按照NCAM/FJB与NeuN/FJB共存比计算,在损伤后的整个急性期(4h)和亚急性期(7d)未成熟神经元与成熟退化神经元恒定的较高比例表明,未成熟的神经元是对海马内创伤性脑损伤耐受性差的主要神经元群。这些定量的结果证实了我们以前的研究结果,结果也表明不成熟的神经元值得作为一个可能的治疗靶点予以重视。为什么不成熟的神经元对创伤性脑外伤的耐受性如此脆弱仍未知。最近有关齿状回新生神经元的发育期间电生理特性的研究表明,新生神经元在电生理上与齿状回颗粒细胞成熟的不同。由于其独特的离子通道表达,新生未成熟神经元比成熟神经元更容易被激活。分析这些电生理特征得出：这些新生神经元对由创伤性脑损伤后受损神经元释放的神经递质夸张兴奋反应将是有意义的。分子生物学技术作为一项新技术为脑损伤研究注入活力,开辟了新的研究领域,但创伤性脑损伤后继发性神经细胞损害的分子生物学机制研究刚刚起步,尚未得出肯定结论。有关脑损伤的基因治疗仍处于动物实验研究阶段,尚未应用于临床治疗脑损伤病人。但无论如何,分子生物学技术应用于脑损伤的研究,将为阐明脑损伤发病机制和开辟脑损伤治疗途径提供有效手段。