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目的:组织缺血再灌注损伤的发生、发展是个多因素协同作用的过程。大量文献报道其发生可能与氧自由基、钙超载、中性粒细胞因素有关。近年来,研究发现多种细胞因子也参与肝缺血再灌注损伤的病理生理的过程。这些细胞因子在肝内既可以单个形式也可通过彼此之间网络状的协同作用的形式而引起肝脏损伤。其中,肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)作为炎症反应的始发细胞因子,在肝脏缺血再灌注损伤中的作用越来越引起人们的关注。目前研究普遍认为,TNF-α在肝脏缺血再灌注中导致损伤加重,但是最近研究发现,在缺血再灌注前应用低剂量的TNF-α进行预处理有一定的肝保护作用。在肝脏缺血再灌注前30分钟,给予低剂量的(1～5μg/kg体重)TNF-α预处理可以降低缺血再灌注后肝脏和血浆中的TNF-α的表达,降低血清中谷丙转氨酶的检验水平,明显减轻肝脏损伤。Teoh等的研究证明,对TNF基因敲除的小鼠进行缺血预处理,无明显的肝保护作用。但是静脉注射低剂量的TNF-α(1μg/kg,模仿了缺血预处理所动员的TNF的剂量)后,在缺血再灌注早期(2h)和晚期(24h)均可观察到缺血预处理的肝保护作用。所以,TNF作为一个关键性的因子调节着缺血预处理的肝保护作用,促进了缺血再灌注损伤时肝细胞的存活。因此,我们应用免疫组化和TUNEL的方法初步讨论TNF-α对肝脏缺血再灌注损伤保护作用的机制,并为研究缺血预处理对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用的机制提供理论依据。方法:采用50只雄性SD大鼠,制成肝脏原位缺血再灌注模型,通过观察形态学变化,使用全自动生化仪法检测谷丙转氨酶,谷草转氨酶水平,免疫组化法测Bcl-2蛋白,核因子NF-κB表达水平,以及使用TUNEL法检测肝细胞凋亡水平,比较肿瘤坏死因子预处理与缺血预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。结果1血清ALT、AST的水平各组的血清ALT、AST水平分别为:S组: 61.6±11.3u/L和75.8±46.6 u/L;IR组: 642.8±149.3 u/L和730.6±103.0u/L;IPC组: 316.4±90.6u/L和376.4±127.0u/L;TPC组: 336.8±79.4u/L和392.7±109.3u/L;TPCS组: 349.8±98.4u/L和425.5±101.1u/L。IR组、IPC组、TPC组、TPCS组转氨酶水平均明显高于低于S组(P<0.01),差异有统计学意义;IPC组、TPC组和TPCS组的转氨酶水平均较IR组明显降低(P<0.01),差异具有统计学意义。而IPC组与TPC组之间则无明显差异(P>0.05)。TPC组与TPCS组之间无明显差异(P>0.05)。IPC组较TPCS组AST水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。2免疫组化法测Bcl-2水平各组细胞指数分别为:S组:12.99±3.21;IR组:11.45±11.97;IPC组:62.30±9.20;TPC组60.99±6.30;TPCS组58.71±11.06。IR组与S组PI水平差异无统计学意义(P>0.05);IPC组、TPC组、TPCS组PI水平均较S组明显升高(P<0.05),具有统计学意义;IPC组、TPC组、TPCS组PI水平均较IR组明显升高(P<0.05),具有统计学意义;IPC组、TPC组以及TPCS组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。3免疫组化法测NF-κB水平各组细胞指数分别为:S组:10.15±4.42;IR组:35.73±5.46;IPC组:68.33±6.07;TPC组:62.80±6.30;TPCS组:60.65±8.58。IR组、IPC组、TPC组、TPCS组PI2水平较S组升高(P<0.05),有统计学意义;IPC组、TPC组、TPCS组PI2水平较IR组升高(P<0.05),有统计学意义;IPC组、TPC组以及TPCS组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。4肝脏细胞凋亡指数TUNEL法测定各组肝组织的凋亡水平,记数500个细胞,计算每100个细胞中的平均阳性细胞数,即凋亡指数(apoptosis index,AI),单位为(%)。各组凋亡指数分别为:S组:1.29+2.67;IR组:9.48±2.42;IPC组:4.36±0.88;TPC组:4.94±2.04;TPCS组:5.04±1.70。IR组、IPC组、TPC组、TPCS组较S组AI水平明显升高(P<0.01),具有统计学意义;IPC组、TPC组、TPCS组较IR组AI明显降低(P<0.01),具有统计学意义;IPC组与TPC组AI差异(P>0.05)无统计学意义;TPC组与TPCS组AI差异(P>0.05)无统计学意义;IPC组较TPCS组AI水平降低(P<0.05),有统计学意义。6 Bcl-2蛋白含量与凋亡指数之间的相关性因空白对照组(S组)仅解剖肝十二指肠韧带而不阻断血流,未进行缺血再灌注,所以,没有受到促进凋亡的损伤,极少发生凋亡。去处空白对照组,对其余各组肝组织Bcl-2蛋白细胞指数与凋亡指数的相关性分析,表明Bcl-2蛋白含量与凋亡指数呈明显负相关。(r=-0.902, P<0.05)7 NF-κB含量与凋亡指数之间的相关性因空白对照组(S组)仅解剖肝十二指肠韧带而不阻断血流,未进行缺血再灌注,所以,没有受到促进凋亡的损伤,极少发生凋亡。去处空白对照组,对其余各组肝组织NF-κB细胞指数与凋亡指数的相关性分析,表明NF-κB含量与凋亡指数呈明显负相关。(r=-0.877, P<0.05)8增大预处理使用的TNF-α量,不能提高保护的效果IPC组与TPC组以及TPCS组的Bcl-2水平(PI)、NF-κB水平(PI2)差异均无统计学意义;TPCS组AST水平较IPC组升高(P<0.05),具有统计学意义;TPCS组AI也较IPC组升高(P<0.05),具有统计学意义;保护效果比IPC组弱。结论1我们在本实验中比较了缺血预处理和TNF-α预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。结果显示,缺血预处理组和TNF-α预处理组血清ALT及AST水平明显低于缺血再灌注组,凋亡指数也明显低于缺血再灌注组,提示TNF-α预处理确实可以模拟缺血预处理对缺血再灌注肝脏的保护作用,且效果明显。但增大TNF-α预处理使用的TNF-α量不能增加其保护作用。甚至在某些组观察到,增大的使用TNF-α剂量会影响到保护作用。2 Bcl-2在所有预处理组表达水平升高,其表达水平于肝细胞凋亡指数成负相关,表明Bcl-2在抑制肝细胞凋亡,减轻肝脏缺血再灌注损伤中,发挥重要作用。3 NF-κB在所有预处理组表达水平升高,其表达水平于肝细胞凋亡指数成负相关,表明NF-κB在抑制肝细胞凋亡,减轻肝脏缺血再灌注损伤中,发挥重要作用。