多功能磁性纳米材料用于循环肿瘤细胞的检测分离研究

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循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)被认为是癌症早期诊断和肿瘤转移检测中一类重要的生物标记物。然而,从复杂血液成分中高效捕获并温和释放稀有的CTCs仍充满挑战。目前,免疫磁分离法由于具有制备简单和易于操作等特点而被广泛应用于CTCs富集,然而该方法采用的识别配体(抗体、适配体、多肽等)存在价格昂贵、容易失活等缺点,并且由于CTCs本身的异质性特点容易引起漏检现象发生。在上皮-间充质转化过程中CTCs表面会过量表达富含脯氨酸的蛋白,研究发现单宁酸(Tannic Acid,TA)不仅对这些富含脯氨酸的蛋白呈现出强亲和力,而且还能有效抵抗血液中白细胞和血小板的非特异性粘附;此外,TA可以与多种金属离子发生螯合作用形成涂层结构,并且这些涂层在细胞培养环境(pH=5.5-7.4)呈现出pH依赖降解行为。受此启发,本论文拟将TA与铜离子(CuII)络合形成的涂层修饰在四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒表面以构建一种多功能纳米材料,从而实现对不同CTCs的高效率和高纯度捕获以及细胞培养过程中的自释放。首先,制备了超顺磁性四氧化三铁(Fe3O4)纳米颗粒和分别涂覆1、3、5层TA-CuII自组装络合物涂层的磁性纳米颗粒(Fe3O4@TA/CuII-1、Fe3O4@TA/CuII-3和Fe3O4@TA/CuII-5)。通过激光粒度仪(DLS)、透射电子显微镜(TEM)表征发现,磁性纳米颗粒的粒径随着涂覆次数的增加不断增大,与之相对应的表面涂层厚度也随之增厚,并且修饰涂层后的纳米颗粒仍具有良好的分散性;接着用X射线能谱仪(EDS)、马尔文纳米粒度电位仪、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)对材料进行表征,证明TA/CuII涂层在材料表面的成功修饰;最后我们用振动样品磁强计(VSM)对四种纳米颗粒的磁响应性能进行表征,结果表明四种纳米颗粒都具有高饱和磁响应强度,并且在外加磁场下能够在1分钟内快速富集。其次,考察了Fe3O4@TA/CuII纳米颗粒对癌细胞的亲和捕获性能。结果显示Fe3O4@TA/CuII纳米颗粒对于人乳腺癌MCF-7细胞具有良好的亲和力,能在1分钟内实现细胞的富集,并且捕获的细胞结构完整。通过优化实验条件发现,与细胞共孵育20分钟,Fe3O4@TA/CuII纳米颗粒(250μg/m L)对于EpCAM阳性和阴性表达的细胞(MCF-7、人肝癌细胞HepG2和人宫颈癌细胞HeLa)的捕获效率均高于80%。在模拟血液样品中,材料对低丰度细胞(100-3000个细胞/m L)的捕获呈现出高灵敏度,并且能够有效抵抗白细胞的粘附。此外,Fe3O4@TA/CuII材料能从不同癌症病人血液中检测出CTCs。最后考察了捕获细胞从纳米颗粒上的自释放行为。在pH=5.5的条件下,Fe3O4@TA/CuII-3纳米颗粒上的涂层不断分解,6小时可降解47.36%。将捕获的细胞置于pH=5.5的培养基中培养6小时后细胞的释放效率能够达到68.38%,通过荧光显微镜和扫描电镜也证明释放后的细胞结构完整且形态均匀。最后释放的细胞在培养48小时后呈现的活性高达94.77%,显示出良好的增殖能力。
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