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第一部分：人皮肤原代角质形成细胞与HaCaT细胞对过氧化氢的不同反应目的：研究正常人皮肤原代角质形成细胞(NHEKs)与HaCaT细胞株对过氧化氢(H2O2)诱导的氧化应激的不同反应,为选择合适的皮肤细胞模型提供依据。方法：收集儿童包皮并分离培养原代角质形成细胞,复苏并培养HaCaT细胞,用150uM H2O2处理第2代人皮肤角质形成细胞和HaCaT细胞2小时后继续培养24小时,MTT法检测其细胞生长活性、比色法检测细胞凋亡相关酶caspase-3/7活性、流式细胞仪检测细胞周期中G1期细胞百分数、细胞凋亡百分数及细胞内ROS水平、WST法检测细胞内SOD酶活性水平、细胞衰老相关p-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞中p-半乳糖苷酶阳性细胞百分数、Western blot检测衰老相关蛋白Klotho表达水平,并对相关数据进行统计分析。结果：经H2O2处理后NHEKs与HaCaT细胞活性均明显下降且呈浓度依赖和时间依赖关系,HaCaT细胞的抑制率高于NHEKs(p<0.05), HaCaT细胞内ROS水平、G1期细胞百分数与细胞凋亡相关酶caspase-3/7活性均高于NHEKs细胞,而NHEKs细胞内SOD酶活性水平则高于HaCaT细胞(p<0.05),H2O2处理后两种细胞衰老相关蛋白Klotho表达均下调,NHEKs与HaCaT细胞均均体积变大、圆顿等衰老表型,NHEKs细胞中SA-P-Gal阳性细胞百分数高于对照组(p<0.05),而处理前后HaCaT细胞中均检测不到SA-P-Gal阳性细胞。结论：NHEKs比HaCaT细胞更能耐受H2O2诱导的氧化应激,细胞经H2O2诱导后,NHEKs既有衰老样的表型,也能表达衰老相关p-半乳糖苷酶,而HaCaT细胞有衰老样的表型,但不表达衰老相关p-半乳糖苷酶。第二部分CD147对氧化应激所致人皮肤成纤维细胞衰老的影响目的：观察CD147对H202所致人皮肤成纤维细胞衰老的影响。方法：收集儿童包皮并分离培养原代成纤维细胞,构建CD147shRNA慢病毒干扰载体,转染第二代成纤维细胞并进行鉴定,100uM H2O2处理转染前后细胞2h,MTT法分别检测诱导后12、24、36、48h细胞生长活性、比色法检测诱导后24h细胞凋亡相关酶caspase-3/7活性、细胞衰老相关p-半乳糖苷酶试剂盒检测诱导后24h细胞中p-半乳糖苷酶活性水平、流式细胞仪检测诱导后24h细胞生长周期中G1期细胞百分数及细胞凋亡率,并对相关数据进行统计分析。结果：观察到干扰组(NHSFs-CD147shRNA组)细胞体积较正常变大、扁平等细胞衰老的形态学表现,其生长活性受到轻度抑制,细胞衰老相关p-半乳糖苷酶、细胞G1期百分数、细胞凋亡相关酶caspase-3/7活性及细胞凋亡率均轻度升高。各细胞组经H202处理后,空载体病毒转染组(NHSFs-virus+H2O2组)细胞较前变大、扁平,少数有多角形等细胞衰老的形态学表现,其细胞生长活性受到中度抑制,细胞衰老相关p-半乳糖苷酶、细胞G1期百分数、凋亡相关酶caspase-3/7活性及细胞凋亡率均中度升高,而CD147干扰组(NHSFs-CD147shRNA+H2O2)细胞体积比对照组明显变大、扁平,并出现多角形等细胞衰老的形态学表现,其生长活性更明显受到抑制。结论：在正常和氧化应激条件下,CD147对成纤维细胞的衰老均有着一定的调控作用,CD147可能是调控人皮肤细胞衰老的重要分子。第三部分CD147对氧化应激所致人皮肤成纤维细胞衰老的保护机制研究目的：探讨CD147对氧化应激所致人皮肤成纤维细胞衰老的可能机制。方法：收集儿童包皮并分离培养原代成纤维细胞,构建CD147shRNA慢病毒载体并转染第二代成纤维细胞,100uM H2O2处理细胞诱导其衰老,流式细胞仪检测细胞内ROS水平、NBT法检测细胞内SOD活性、Western blot检测处理后细胞衰老相关蛋白Klotho表达水平,并对相关数据进行统计分析。结果：干扰成纤维细胞中CD147表达后,其细胞内荧光强度稍升高,NHSFs-CD147shRNA组细胞内荧光强度几何均值为7.30±0.58,NHSFs-virus组细胞内荧光强度几何均值为6.87±0.42(P>0.05)；细胞经H2O2处理后,NHSFs-virus+H2O2组细胞内荧光强度几何均值为17.62±1.12,较NHSFs-virus组升高(P<0.05),而NHSFs-CD147shRNA+H2O2组细胞内荧光强度几何均值28.91±1.33,较NHSFs-CD147shRNA组与NHSFs-virus+H2O2组明显升高(P<0.05)。CD147干扰前后,细胞内SOD活性无明显变化,NHSFs-virus组细胞内SOD活性为0.28±0.06U, NHSFs-CD147shRNA组细胞内SOD活性为0.26±0.03U(P>0.05)；细胞经H202处理后,NHSFs-virus+H2O2组细胞内SOD活性为2.18±0.17U,较对照组NHSFs-virus明显升高(P<0.05),NHSFs-CD147shRNA+H2O2组细胞内SOD活性为0.88±0.06U,较对照组NHSFs-CD147shRNA轻度升高(P<0.05),而NHSFS-Virus+H202组细胞内SOD活性较NHSFs-CD147shRNA+H202组高(P<0.05)。细胞经H2O2处理后,NHSFs-virus+H202组细胞衰老相关蛋白Klotho的表达下调,而干扰细胞中CD147的表达后,H202处理前后均检测不到衰老相关蛋白Klotho的表达.结论：在氧化应激条件下,CD147通过与皮肤成纤维细胞内增加的SOD一起加速对细胞内ROS的清除,减少ROS在细胞内的聚集,从而减轻细胞因氧化应激所致的损伤和衰老,该过程可能与Klotho蛋白相关,CD147可能通过调控细胞衰老相关蛋白Klotho表达而延缓细胞衰老。